2.2.1.Физические методы иммобилизации ферментов

Методы иммобилизации, при которых фермент или клетка связываются с матрицей без образования ковалентных связей, называют физическими. Все существующие методы физической иммобилизации можно разделить на 4 группы: адсорбционная иммобилизация на нерастворимых носителях, иммобилизация путем включения в гели, иммобилизация микрокапсулированием в полупроницаемые оболочки и волокна, включение в двухфазную реакционную среду.

Адсорбционная иммобилизация. При адсорбционной иммобилизации фермент или клетка удерживается на поверхности носителя с помощью электростатических, гидрофобных и водородных связей. Для этих целей применяют неорганические (оксиды алюминия и титана, керамика, уголь) и органические (полисахариды, ионообменные смолы белки), нерастворимые носители в виде порошков, шариков, гранул или больших кусков с узкими каналами. Основные характеристики носителей механическая прочность, химическая инертность, размер пор, удельная поверхность. Из-за простоты, доступности, невысокой сорбентов и сохранения высокой каталитической активности биокатализаторов адсорбционная иммобилизация наиболее часто применяемых метод. Главный недостаток метода – возможность непрочного связывания фермента и носителя.

Существую несколько способов получения биокатализаторов с помощью адсорбции на носителе (Рис.2.1)

Статический способ. Носитель вносят в водный забуференный раствор фермента и оставляют на несколько суток без перемешивания. Сорбция достигается за счет самопроизвольной диффузия фермента к поверхности носителя с последующей адсорбцией. Сейчас очень редко применяют из-за длительности.

Способ с перемешиванием. Смешивают (на качалке, мешалкой, покачиванием) фермент или суспензию клеток с носителем, уравновешенным буферным раствором. Затем отделяют биокатализатор от раствора центрифугированием или фильтрованием и снова ресуспендируют. Эту стадию повторяют несколько раз, пока не исчезнут активность фермента или клетки в промывных водах. Затем комплексы суспендируют в определенном объеме соответствующих буферов, уравновешивают и хранят в холодильнике. Этот способ эффективнее статического, поскольку обеспечивает более равномерное заполнение поверхности носителя адсорбированным ферментом.

Метод элекетроосаждением. Основан на том, что молекулы ферментов имеют на поверхности заряженные группы. Если в раствор фермента погрузить два электрода, на поверхности, одного из которых помещен слой носителя, то при включении электрического тока молекулы фермента начнут перемещаться в растворе в сторону соответствующего электрода и осаждаться на носителе.

В промышленных условиях в технологии чаще применяют метод нанесения на колонке (Рис.2.2). В этом случае через колонку с носителем насосом прокачивают раствор фермента или снизу вверх, или сверху вниз. Скорость потока подбирается так, чтобы частицы носителя оставались в взвешенном состоянии, образуя кипящий слой. Используя этот метод можно в одной и той же колонке проводить иммобилизацию фермента, промывку и ферментацию.

Природа адсорбционных взаимодействий фермента и носителя может быть различной (Рис.2.1). Удержание может обеспечиваться за счет Ван-дер-ваальсовых взаимодействий, электростатических взаимодействий, водородных связей и гидрофобных взаимодействий между носителем и поверхностными группами белка. Вклад каждого из перечисленных типов зависит от химической природе носителя и функциональных групп на молекуле фермента или белка и липидов на поверхности клетки. Чаще всего основной вклад вносит электростатическое взаимодействие и водородные связи.

Эффективность адсорбционной иммобилизации зависит от многих факторов. В общем случае сорбционная емкость носителя пропорциональна его удельной поверхности. Для ферментов это справедливо в случае, когда носитель не пористый или диаметр пор намного больше размеров белков. Если поры маленькие, то удельная поверхность больше. Однако количество ферментов, способных, то удельная поверхность больше, т.к. белки не взаимодействуют с поверхностью выстилающей поры изнутри. В соответствии с экспериментальными данными считается, что диаметр пор должен быть в 2 раза больше размера молекулы фермента в направлении его максимального удлинения. Здесь нужно иметь в виду, что молекула субстрата меньше молекулы фермента. В другом случае, носитель нужно подбирать по размеру субстрата. Причём высокомолекулярный субстрат сам может выступать носителем для иммобилизации фермента.

Если сорбция осуществляется за счёт электростатических взаимодействий, то естественно этот процесс будет сильно зависеть от pH среды. При изменении рН изменяется состояние ионогенных групп носителя и белка. Если носитель не является ионообменником, максимальная сорбция достигается в изоэлектрической точке белка. Т.е. рН зависимости адсорбции должна иметь вид кривой с одним масимумом, соответствующим изоэлектрической точке.

Ионная сила только оказывает влияние на прочность связывания фермента с носителем из-за конкуренции связывания с носителем между ферментом и ионами в растворе. Тогда может наблюдаться десорбция биокатализатора. Это зависит от ионной силы раствора, т.е. концентрации солей.

Степень адсорбции и количество адсорбированного биокатализатора на носитель в значительной степени, зависит от концентрации фермента в растворе, из которого происходит адсорбция. Если увеличивать концентрацию до определенного предела, то увеличивается количество адсорбированного биокатализатора и, следовательно, растет удельная каталитическая активность иммобилизованной системы. Дальнейшее повышение концентрации фермента не будет приводить к повышению удельной активности иммобилизованного препарата т.к. носитель имеет ограниченное число центрового связывания. Кроме того, ферменты могут наслаиваться друг на друга, что приводит к появлению диффузионного барьеру для субстрата.

Для удачного проведения адсорбции нужно подобрать оптимальную температуру. Увеличение температуры оказывает двоякое влияние на процесс адсорбционной иммобилизации. Рост температуры увеличивает скорость диффузии фермента в порах носителя, но в тоже время сильное увеличение вызывает уже денатурацию белка.

Таким образом, эффективность адсорбционной иммобилизации биокатализаторов зависит от целого ряда факторов, которые должны быть точно сбалансированы.

Для повышения прочности связывания адсорбционно-иммобилизованных ферментов часто носитель предварительно модифицирует. В данном случае под модификацией нужно понимать не только включение в носитель каких-либо дополнительно функциональных групп. Но и изменение его физико-химических свойств. Например, если фермент не стабилен в кислой среде, а поверхность носителя имеет кислый характер, то необходимо перед иммобилизацией носитель выдерживать в соответствующем буферном растворе.

Особый подход требуется для иммобилизации металлозависимых ферментов. Из-за способности большинства носителей селективно прочно связывать ионы металлов, при иммобилизации металлоэнзимы могут терять ионы металлов их активного центра. Чтобы исключить потерю металла можно предварительно заблокировать центры связывания ионов металлов на носителе теми же (или им подобными) ионами.

Доиммобилизационная обработка носителя ионами металлов для некоторых ферментов служит фактором, увеличивающим прочность связывания фермент-носитель. В этом случае ион металла выступает в роли мостика между биокатализатором и носителем.

Среди способов усиления способности носителя к связыванию фермента следует отметить обработку носителя веществами, молекулы которых содержат много функциональных групп, способных к взаимодействию с группами на поверхности глобулы фермента или клетки за счет электрических и водородных связей. Для этого поверхность носителя полимеризуют, затем проводят химическую модификацию полимера. За счет этого на поверхности носителя образуется большая концентрация функциональных групп – гидроксильных, гидрофобных и т.д. Иногда перед иммобилизацией на носитель за счет адсорбции наслаивают сывороточный альбумин, которые затем искусственно денатурируют, а функциональные группы на поверхности остаются.

На поверхности ферментов, наряду с полярными участками, часто присутствуют гидрофобные зоны, т.е. связывание фермента или клетки с носителем, имеющим гидрофобные участки, может обеспечиваться и за счет гидрофобных взаимодействий. При этом способе агарозы, ковалентно модифицируют гидрофобными группами (алкильными, фенильными). Эффект связывания увеличивается, если на носителе присутствует еще и заряженная группа. Т.е. наблюдается двойной эффект фермент связывается с носителем и за счет гидрофобных и за счет электростатических взаимодействий.

В этом плане очень удобными для модификации являются липиды являющиеся, как вам известно, амфифилами, т.е. имеют четко выраженные гидрофильные и гидрофобные участки. По желанию монослой липидов можно так адсорбировать на поверхности носителя, что поверхность будет иметь или гидрофобный характер или гидрофильный.

В ряде случаев для повышение эффективности иммобилизации необходимо модифицировать не носитель, а фермент. Особенно это важно при иммобилизации на ионообменных, из-за того, что иногда очень близки изоэлектрическая точка и рН – оптимум фермента. Поэтому прочная сорбция наблюдается лишь в областях рН, далеких от изоэлектрической точки, где каталитическая активность мала. Для снятия этого препятствия в фермент вводят дополнительные ионогенные группы (органические кислоты, карбоксиметилцеллюлозу), которые смещают изоэлектрическую точку фкатализатора.Чтобы исключить смывание уже иммобилизованного фермента с носителя адсорбированный фермент обрабатывают бифункциональным сшивающим агентом. Это приводит к тому, что на поверхности носителя образуется сплошная пленка из сшитых между собой молекул фермента. В качестве сшивающего агента чаще всего применяют глутаровый альдегид.

Иммобилизация включением в гели. Для проведения иммобилизации в органические гели готовят реакционную смесь не следующих компонентов – фермент, мономер, и при необходимости сшивающий агент, водный буферный раствор. Часто еще добавляют вещества, предохраняющие фермент от инактивации при гелеобразовании. Готовую смесь подвергают воздействию какого-либо фактора инициирующего процесс полимеризации мономера (рис.2.3А) При проведении полимеризации в ПААГ используют мономер и сшивки в концентрациях 30-60 и 5% от общей массы реакционной смеси соответственно. Инициаторами полимеризации являются радикалы. Радикалы могут образовываться в результате некоторых окислительно-востановительных и фотохимических реакций. Чаще применяется окислительно-востановительная пара: персульфат калия или аммония-тетраметилэтилендиамин. При внесении этих веществ в раствор происходит полимеризация. Для фотохимического инициирования применяют рибофлавин. Иногда полимеризацию можно проводить также при воздействии ионизирующей радиации без инициатора.

Рис. 2.3. Иммобилизация ферментов и клеток включением в гели А – включение в гели, полученные полимеризацией мономеров; Б - включение в готовые природные гели

Процесс полимеризации ингибируется наличием молекулярного кислорода и в процессе полимеризации выделяется большое количество тепла (нагрев до 70-750С). Чтобы избегать этих артефактов можно насытить рабочий раствор инертным газом и работу проводить при невысоких температурах. За определенное время (мин, часы) образуется блок полимерных гелей, содержащий иммобилизованный фермент. Этот блок измельчают, продавливая через сито, или нарезая. Тщательно промывают буферным раствором, до тех пор, пока в промывных водах ферментативная активность не будет минимальной. Если включали клетки, то в водах определяют наличие свободных клеток. Для длительного хранения измельченный гель с биокатализатором подвергают лиофильной сушке.

Некоторые природные полисахариды – крахмал, агар-агар, карраганан, агароза – способны образовывать гели при охлаждении их горячих водных растворов. 2-5% раствор полисахарида нагревают при постоянном перемешивании до 80-900С и затем охлаждают постепенно. Перед началом гелеобразования (30-50⁰С) в систему добавляют водный раствор биокатализатора (фермента) или суспензию клеток. При дальнейшем охлаждении образуется гель, содержащий иммобилизованный биокатализатор (Рис. 2.3Б). Для повышения механической прочности процесс гелеобразования иногда проводят в порах вспененного полиуретана или выдерживают в холодных растворах хлористого калия или кальция.

Для более прочного удерживания включенного в них фермента в полимер вводят ковалентные сшивки. Сшивки между полимерными цепями можно добиться при обработке их бифункциональными реапгентами. Образование прочных связей между полимерными цепями геля может достигаться и за счет электростатических взаимодействий. Например, в присутствии Са альгинат натрия дает прочный гель. В этом случае в роли мостиков между полимерными цепями выступают ионы Са, формирующие ионные связи с карбоксильными группами альгината.

Сшитые гели для иммобилизации могут быть получены на основе поливинолового спирта и поливинилпирролидона. Если на растворы (водные) этих веществ воздействовать излучением или потоком электронов, то в их полимерных цепях возникают свободные радикалы. При взаимодействии этих свободных радикалов между цепями образуются ковалентные сшивки.

В настоящее время широко применяют метод иммобилизации биокатализаторов путем включения в полимерную матрицу из фотополимеризующихся смол (полимеры-макромономеры). Во время иммобилизации раствор, содержащий смолу, катализатор и инициатор облучают несколько минут УФ-лучами. Фоточувствительные группы образуют между собой ковалентные связи, и возникает сшитые 3-х мерная полимерная сетка и включением в нее молекулами биокатализатора.

Каталитическая активность иммобилизованного биокатализатора возрастает с увеличением количества включенного фермента. На первый взгляд можно такого увеличения добиться, просто повышая концентрацию фермента в исходной смеси.

На самом деле это не так, поскольку растворимость ферментов в гелеобразующих системах ограничена. Далее здесь важно учитывать и прочность удерживания биокатализаторов носителем. А это зависит от размера пор. Чем меньше диаметр пор, в сравнении с размером биокатализатора, тем меньше вероятность смывания катализатора реакционной средой. Пористость геля можно регулировать изменением состава исходной смеси – например мономера. Кроме того, высокая концентрация фермента приводит к тому, что субстрат не достигает ферментов в глубине матрицы. В этом случае препарат с иммобилизованным биокатализатором измельчают, продавливая через сито или гомогенизируя, чтобы увеличить удельную поверхность.

Чаще получаемые частицы не очень прочны, крайне неоднородны, и поверхностные катализаторы легко смываются. Этих недостатков можно избежать при использовании эмульсионного способа получения гелевых частиц (Рис.2.4). Приготовленный водный раствор с ферментом, мономером и инициатором сразу вводят в неполярный органический растворитель с ПАВ и перемешивают. Образуется эмульсия, состоящая из стабилизированных в органической среде капель водного полимеризующегося раствора, стабилизированного ПАВ. После окончания полимеризации частицы геля форме шариков промывают фильтре водой. Гелевые частицы характеризуются высокой механической прочностью, и исключается опасность инактивации фермента теплом, выделенным при полимеризации (высокий теплообмен).

Для практических целей удобен метод двойной иммобилизации, при котором в гель на твердом носителе, или же получение полимерного геля с включением фермента проводится в присутствии такого носителя.

Есть еще один параметр, от которого зависит эффективность иммобилизованного биокатализатора. Как биологи мы знаем, что для работы фермента нужно какое-то минимальное микроокружение. Вот эту оптимизацию микроокружения можно достичь подбором соответствующей гелеобразующей системы. Т.к. эффективность зависит от природы геля. Варьируя химическую природу исходного мономера (материала гелеобразующего) можно получать матрицы с подходящими для данной ферментативной реакции характеристиками – зарядом, гидрофобностью и т.д.

Несмотря на все преимущества иммобилизации путем включения в гели, которые вы, надеюсь, поняли, есть недостаток. Этот недостаток заключается в том, что полимерная матрица создает значительные препятствия диффузии субстрата к катализатору (диффузионный барьер). Этот барьер увеличивается, если биокатализатором служит не фермент, а клетка. Для уменьшения диффузионного барьера применяют различные подходы – используют органические растворители или прошивают отверстия с помощью лазера и т.д.

Иммобилизация с использованием мембран и волокон. Микрокасулирование. В отличие от других методов иммобилизации, при микрокапсулировании главным является удержание раствора, а не создание физических и химических сил, необходимых для иммобилизации. Т.е. иммобилизуется целиком исходный раствор, содержащий биокатализатор, а не отделенные молекулы или клетки. Суть метода состоит в том, что водный раствор фермента включает внутрь микрокапсул, представляющее собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой полимерной сеткой. Этот метод включает следующие стадии (Рис.2.5):

1.Фермент растворяют в подходящем буферном растворе, обычно содержащем для защиты фермента от денатурации другие белка, например альбумин в концентрации 10%.

2.Готовят органическую фазу, содержащую небольшое количество эмульгатора (ПАВ). Органическая фаза не должна смешиваться водой (эфир, циклогексан, толуол).

3.Добавляют водный раствор фермента к органической фазе и перемешивают в течении заданного времени (1-2 ч.) определенной скоростью вращения. От этого зависит размер микрокапсул.

4.При перемешивании к этой двухфазной смеси добавляют также органический растворитель, содержащий полимер (нитрат целлюлозы, бутадиеновый каучук).

Этот полимер, соприкасаясь с поверхностью эмульсионных капель, будучи нерастворим в воде, образует тонкую оболочку микрокапсул. Это обусловлено также подавлением разбавлением органического растворителя.

5. При упаривании растворителя из органической фазы, из-за увеличения концентрации полимера, происходит дальнейшее осаждение с образованием более плотной мембраны. Толщина мембраны зависит от количества полимера, добавленного к органической фазе и времени преципитации.

6.Микрокапсулы из органической фазы выделяют осаждением, центрифугированием или фильтрацией.

Включение в мембраны и волокна. Метод включения в волокна от микрокапсулирования отличается в основном формой полученных препаратов – образуются нити. Эмульсию водного раствора фермента в органическом растворе волокнообразующего полимера (производные целлюлозы, поливинилхлорид и т.д.) продавливают через прядильное устройство (фильтр) в коагулирующую жидкость (толуол). Полученные волокна представляют собой пористые полимерные гели, содержащие гомогенную дисперсию небольших капель водного раствора фермента. Эти волокна обладают высокой механической прочностью. Из них даже можно изготовить ткань, обладающую ферментативной активностью. Для дополнительного повышения механической прочности волокна иногда заключают в тонкую полиамидную оболочку.

Можно использовать и промышленные готовые полимерные полые волокна, применяемые для диализа белков.

Хорошим материалом в качестве носителя ферментов являются липиды. Известно, что липиды обладают ярко выраженными гидрофобными и гидрофильными свойствами. Т.е., они могут образовывать моно и бислои, сферы (липосомы). Причем взаимное расположение молекул липидов в этих образованиях будет зависеть от окружающей среды (Рис. 2.6.).

Иммобилизация с использованием двух фазных систем. Особенностью этого способа является то, что фермент растворяется только одной из фаз 2-х фазной системы. А субстраты и продукты распределены между двумя фазами. Причем система подбирается так, чтобы продукт накапливался в этой фазе, где отсутствует фермент. После окончания процесса фазу с продуктом отделяют и извлекают продукт, а фазу с ферментом используют вновь. Достоинство этого метода, осуществление превращения крупных макромолекул.

Например, если взять 2-х фазную систему вода 1-2% и органический неполярный растворитель, то ферменты (белки) будут в водной фазе, т.к. они не растворяются в неполярных органических растворителях. Субстрат будет перерабатываться в водной фазе, а продукт будет диффундировать (экстрагировать) в неполярную фазу (Рис.2.7.а). Основной недостаток – инактивация ферментов на границе раздела.

Для увеличения эффективности в качестве ферментсодержащей фазы применяют крупнопористые стекло частицы, которого пропитаны водным раствором фермента (Рис. 2.7.б). В этом случае возрастает поверхность раздела и можно перемешивать.

В этих же целях используют бездетергентные микроэмульсии. При определенных соотношениях смеси гексан - изопропиловый спирт - вода, толуол – изопропиловый спирт - вода, молекулы воды существуют в ней в виде сферических капсул стабилизированных адсорбированными на их поверхности молекулами изопропилового спирта. При растворении в такой смеси молекулы фермента оказываются включением в водные микрокапли, с сохранением их каталитической активности. Если изменить состав смеси происходит расслоение на водную и органическую фазу содержащие, соответственно фермент и продукты реакции.

Таким образом, известно 4 основных вида физических методов иммобилизации: адсорбционная, включение в гели, иммобилизация с использованием мембран, и иммобилизация с использованием 2-х фазных систем. Общим для всех этих способов иммобилизацией является то, что биокатализатор не образует ковалентных связей с носителем, а удерживается за счет слабых взаимодействий или за счет пространственных ограничений, или за счет различий в растворимости.