1.3.4.Кинетика ферментативных реакций.

Браун А, и Анри В. впервые высказали мысль о том, что в основе ферментативной реакции лежит обратимое взаимодействие S и Е с образованием комплекса, который позже распадается с образованием продуктов и регенерацией исходного фермента.

Ферментативную реакцию в простом случае одностороннего превращения одного субстрата можно выразить общим уравнением:

В соответствии с этой схемой [S] обратимо реагирует с [E] с образованием ФСК [ES]. Этот комплекс называют комплексом Михаэлиса.

Допустим, что ФСК все время находится в равновесии с исходными веществами. Другими словами равновесие на первой стадии устанавливается быстро и не нарушается высвобождением фермента от ES в направление k ₊₂

Скорость ферментативных превращений субстрата равна скорости образования продукта (2-я стадия), если [S] >> [E]0, что бывает чаще, где [E]0 – концентрация фермента в начальный момент и равен

Это и есть уравнение Михаэлиса-Мэнтен.

K_S – субстратная константа = 1/K_P (K_P- константа равновесия).

Однако в этом уравнении отсутствует константа образования продукта k₊₂. Холдейн и Бригс вывели уравнение более полно описывающее зависимость скорости от концентрации субстрата.

Исходя из уравнения ферментативной реакции мы можем написать уравнение скоростей образования и распада ФСК.

При достаточно быстром протекании стадии образование ФСК и его превращения в продукт может быть реализовано состояние, когда концентрация [ЕS] меняется во времени медленнее, чем концентрация [S] и [Е]. Это случай возможен при [E]₀ << [S].

Экспериментально доказано, что в реакциях при оптимальных условиях и при [S] >> [E]₀ быстро наступает стационарное течение процесса, при котором распад [ES] по направлению k_-1 и k₊₂ уравновешивается его образованием в направлении k₊₁. Тогда для стационарного состояния можно написать

k-₁ [ES]+k₊₂ [ES] = k₊₁ [E][S]

или (k _-1 +k ₊₂) [ES] = k ₊₁ [E] [S] (11)

Обозначим общую концентрацию фермента через [E]₀, тогда

[E]₀ = [E]+[ES] и отсюда [E]=[E]₀-[ES](12).

Подставим [E] из уравнения 12 в уравнение 11 и получим:

(k _–1 + k ₊₂) [ES] = k ₊₁ ([E]₀ – [ES]) [S] (13). Отсюда найдем [ES].

(14)

разделим числитель и знаменатель на k +1 получим выражение:

(15)

Обозначив (15)

Получим (16)

Скорость может быть выражена (17)

Подставим значение [ES] из уравнения 16 в уравнение 17 и получим уравнение Холдейна-Бригс (ХБ), более известного как уравнение Михаэлиса-Ментен (ММ).

Получим (18)

Рассмотрим внимательно выражение: K_M – константа Михаэлиса, одна из важнейших констант в кинетике ферментативных реакций.

Если k_–1 >> k₊₂, т.е. если обратный распад ФСК на исходные вещества происходит гораздо быстрее его превращение в продукт, то можно пренебречь k₊₂ и уравнение ХБ. прейдет в уравнение ММ. Это условие совпадает с предположением о существовании равновесия на первой стадии в ходе всего процесса. Т.е. принцип стационарности позволяет получить более общую форму уравнения М.М., уравнение Х.Б.

Уравнение Х.Б. в целом хорошо описывает экспериментальные данные по кинетике ферментативных реакций. Чаще всего оно принимается в дифференциальной форме, связывающий начальную скорость превращения субстрата с его начальной концентрацией при заданном количестве внесенного фермента: (19)

Это объясняется тем, что в ходе реакции могут появиться некоторые дополнительные эффекты – торможение продуктами, инактивация ферментов и т.д., которые искажают ход временной зависимости по сравнению с уравнениями М.М., Х.Б.

Взаимосвязь начальной скорости реакции [v]₀ и начальной концентрации субстрата [s]₀ по уравнению Х.Б. представляет собой функцию имеющую свои характерные особенности (Рис.1.15).

При достаточно малых концентрациях субстрата, когда KM >> [s₀] уравнение переходит в линейную форму (20) , а при больших [s]₀, если [s]₀ >> KM кривая стремится к предельному значению k₊₂[E]₀ , которую обозначают через V_m. Тогда V_m = k₊₂[E]₀ (21). Если V₀=1/2 V_M, то [s]₀=K_M. В силу изложенного уравнения Х.Б. часто представляют в форме, удобной для практической обработки экспериментальных данных:

(21)

Константы этого уравнения характеризуют активность фермента и его сродство к данному субстрату, поэтому целью кинетического исследования является прежде всего нахождение значений V_M и К_M . наиболее простое такое исследование выполняется в виде серии экспериментов при постоянной концентрации фермента [E]₀ и изменяющихся начальных концентрациях субстрата [s]₀. В ходе каждого опыта изучается лишь начальный участок кинетической кривой для определения начальной скорости реакции V₀ имея набор значений V₀ при известных [s]₀ легко найти кинетические константы.

Для этой цели удобны уравнения и графики Лайнуивера – Берка (Рис.1.16). Общим свойством дробных рациональных функций, имеющих в числители произведения, а в знаменателе сумму некоторых величин является их способностью переходить в линейную форму при обращении левой и правой части равенства: (22)

при 1/s₀=0 имеем т.е. прямая пересекает ось ординат в точке 1/V_M, а при 1/v₀=0 1/s₀=- 1/K_M . Таким образом, при продолжение прямой в отрицательную область до пересечения с осью абсцисс она отсекает на оси отрезок =- 1/К_M

Недостатком координат Лайнуивера-Берка (ЛБ). является экстраполяция прямой влево до пересечения с осями ординат, что приводит к ошибкам.

Одно из удобных решений исключающих недостаток графиков Л.Б. заключается в использовании координат Эди-Хофсти (Рис.1.17) и описываемых уравнением Эди-Хофсти (24)

В координатах с отрицательным углом наклона отсекается на осях ординат отрезок, равный V_M, а на оси абсцисс отрезок равный V_M/K_M.

Недостаток такого метода обработка является возможность возрастания ошибок при делении, 2-х величин V₀ и s₀ каждая из которого измерена с ошибкой.

Определение V_M=k₂[E]₀ позволяет по известной мольной концентрации катализатора найти k ₊₂ – константу скорости распада ES. Константа Михаэлиса определяет стационарную концентрацию ФСК (25). Однако с помощью К_М в общем случае нельзя найти ни отдельные элементарные константы k _-1 и k₊₁ ни их отношение – субстратную константу КS . для определения К₁ нужно изучать кинетику нестационарной реакции на самых первых стадиях, что для быстрых каталитических реакций представляет большие экспериментальные трудности и часто связано с диффузионными ограничениями. Поэтому обычно величину К_М рассматривают как некоторую эффективную величину, представляющую совокупность элементарных констант. Естественно, что при k ₊₂ << k _-1 стационарная концентрация комплекса E-S мало отличается от равновесной, а К_М равно субстратной константа К_S константе диссоциации комплекса ES: К_М=К_S . Для многих ферментативных реакций раздельное определение К_S и K_M показало, что эти величины отличаются мало, исключение составляет каталаза, пероксидаза. Как обычно K_M лежит в пределах 1-10^-8м/л, но чаще встречаются значения 10^-4 M/л.

При уверенности отсутствия посторонних факторов и располагая математическим выражением для скорости ферментативной реакции, (уравнение Х.Б. М.М.) мы можем определить изменение концентрации реагентов во времени путем интегрирования уравнения методом разделения переменных:

(26)

интегрирование в пределах от 0 до t и соответственно от S0 до S приводит к уравнению Уоелкера-Шмидта (Рис.1.18). (27)

Надо иметь виду, что на практике это уравнение проще использовать для расчета времени t, необходимого для достижения определенных концентраций субстрата, а не наоборот.