1. Учет посева на скошенном агаре

3-ий день бактериологического исследования начинают с просмотра посевов на скошенном агаре. При правильно произведенном посеве (накопление чистой культуры) рост бактерий должен быть однородным (одинаковым на всей поверхности скошенного агара). Посевы с неоднородным ростом на скошенном агаре для дальнейшей работы использовать нельзя! Характер роста на скошенном агаре может быть различным: по штриху, сплошным, сливным, редко в виде изолированных колоний (Поверхность, цвет, консистенция такие же как у исходных колоний на чашке с МПА).

Рост на скошенном агаре – одно из проявлений культуральных свойств бактерий.

2. Приготовление мазков с окраской по Граму для подтверждения чистоты накопленной культуры

3. Иммерсионная микроскопия проводится для подтверждения чистоты накопленной культуры).

Для проверки чистоты накопленной на скошенном агаре культуры из нее готовят мазок, окрашивают по Граму, микроскопируют. Если культура чистая, то в мазке будут видны одинаковые по морфологии клетки, такие же как в мазке из соответствующей колонии во 2-ой день бактериологического исследования. Если культура чистая, то приступают к изучению ее биохимических свойств – основной задаче 3-его дня бактериологического исследования.

4. Определение биохимических свойств и подвижности

У каждого вида бактерий набор ферментов строго индивидуален, поэтому изучение биохимических свойств важно для определения вида. Для изучения биохимических свойств обычно используют набор дифференциально-диагностических сред, называемый “пестрым рядом”. В его состав входят среды Гисса с углеводами, лакмусовое молоко, желатин, МПБ. Среды Гисса готовят на жидкой или полужидкой мясо-пептонной основе, добавляя тот или иной углевод и индикатор. Если при росте бактерии расщепляют углевод среды Гисса, то появляются кислые продукты, рН среды становится кислой и индикатор меняет свой цвет (Незасеянные среды Гисса бесцветны). При более глубоком расщеплении углеводов появляется СО₂. Это выявляется по пузырькам газа в глубине полужидкой среды Гисса. При использовании жидких сред Гисса в них помещают стеклянный поплавок, который при заполнении газом всплывает на поверхность среды. Среды Гисса предназначены для изучения сахаролитической активности бактерий. Если бактерии не расщепляют тот или иной углевод, изменений соответствующей среды Гисса не происходит.

Протеолитическую активность бактерий изучают при посеве на желатин и лакмусовое молоко, при наличии протеаз у бактерий желатин разжижается. В молоке появляется сгусток кремового цвета, а над ним светлая, прозрачная жидкость. Это явление называется пептонизация молока, т.к. протеазы бактерий расщепляют казеин молока до пептонов. Следует помнить, что молоко – это сложная естественная среда. Оно содержит не только белок, но и в большом количестве молочный сахар (лактозу) и небольшое количество глюкозы. При наличии сахаролитической активности бактерий лакмусовое молоко розовеет (расщепление только глюкозы) или розовеет и створаживается (расщепление глюкозы и лактозы).

Расщеплять белки могут не все бактерии. Чаще бактерии способны расщеплять промежуточные продукты распада белков – пептоны, т.е. обладают пептолитической активностью. Продуктами распада пептонов являются: амины (скатол, индол), аминокислоты, газы – сероводород, аммиак, углекислый газ. Их легко обнаружить, укрепив под пробкой пробирки с МПБ индикаторные полоски: лакмусовую для выявления аммиака, смоченную щавелево-уксусной кислотой (реактив Мореля) индола, уксусно-кислым свинцом – сероводорода. Лакмус синеет в присутствии аммиака, реактив Мореля розовеет в присутствии индола, а при наличии сероводорода на индикаторной полоске образуется черная соль сульфида свинца.

Тест на окисление-ферментацию (OF-тест) предназначен для установления путей расщепления углеводов бактериями, что характеризует определённые семейства (у энтеробактерий расщепление углеводов происходит ферментацией, у псевдомонад - окислением). Для постановки теста используют среду Хью-Лейфсона. Среду разливают высоким столбиком и посев культуры производят уколом. Если бактерии расщипляют углеводы путём ферментации, происходит изменение цвета среды на всей высоте столбика, если путём окисления – изменение цвета среды отмечается только в верхней части столбика.

Тест на наличие фермента цитохромоксидазы ставят для дифференциации аэробных и факультативно-анаэрбных бактерий. На индикаторную тест-полоску наносят петлёй чистую культуру бактерий. При наличии оксидазы отмечается появление синего окрашивания.

Посевы на среды “пестрого ряда” помещают в гермостат на 24 часа при температуре 37°С. Одновременно выполняют посев на среду Пешкова для изучения подвижности и тоже помещают в термостат при температуре 37°С.Подвижность бактерий связана с наличием на поверхности их клеточной стенки жгутиков – специальных органелл из белка флагелина. Бактерии могут иметь: 1) жгутик – монотрихи, 2) по одному на разных полюсах – лофотрихи, пучок жгутиков по периметру клетки – перитрихи.

Жгутики можно увидеть при специальных методах окраски при иммерсионной микроскопии или при электронной микроскопии. Чаще изучают не наличие самих жгутиков, а их функцию – подвижность. Подвижность можно наблюдать при фазово-констрастной микроскопии живых бактерий в препаратах “висячей” или раздавленной капли. Чаще подвижность оценивают косвенно по характеру роста в среде Пешкова (0,3% полужидком агаре с индикатором ТТХ). Посев производится уколом и через 24 часа инкубации в термостате подвижные культуры дают диффузный рост, а неподвижные – рост по уколу. Для оценки выраженной подвижности бактерий рода протей можно использовать посев по Шукевичу: при посеве в каплю влаги на скошенном агаре бактерии “всползают” (ползучий рост) по поверхности скошенного агара.