3. Визначення білку за методом Лоурі

Метод оснований на хромогенній природі деяких бокових груп амінокислот та присутності в білках пептидних звязків. Дуже чутливий, визначає 0,005-0,1 мг білку в пробі. Синє забарвлення, що виникає, в основному визначається реакцією фенольного реагенту (реактив Фоліна-Чікольте) з залишками амінокислоти Tyr, деякий вклад вносять інші амінокислоти Trp, His, Cys та пептидні звязки.

Реактиви:

1. А – 2%-ний розчин Na₂CO₃ в 0,10 M NaOH;

2. Б – 0,5%-ний розчин CuSO₄5H₂O в 1%-ному Na- або К-тартраті;

3. В – приготування лужного розчину міді: змішують 50 мл реактиву А та 1 мл реактиву Б. Придатний для використання протягом 2 діб;

4. Г – змішують 50 мл 2%-ного розчину Na₂CO₃ з 1 мл реактиву Б. Придатний для використання 1 добу;

5. Д – реактив Фоліна-Чікольте. Після приготування використовують в той же день. Використовують готовий реактив з більш довгим терміном зберігання при 0-4⁰ С. Такий реактив перед використанням титрують аліквоту до рН 10,0 по фенолфталеїну, на основі результатів титрування розбавляють реактив приблизно в 2 рази до концентрації 1 моль/л.

Матеріали та обладнання: 2 штативи з пробірками, дозатори або піпетки, ФЕК з довжиною хвилі 750 нм, міліметровий папір, олівець, лінійка.

Хід роботи

В пробірку на 3-10 мл вносять 0,6 мл розчину білку (5-100 мкг), долива-ють 3 мл реактиву В, перемішують і залишають на 10 хвилин. Потім швидко доливають 0,3 мл реактиву Д, перемішують (загальний обєм 3,9 мл), витриму-ють 30 хв. або трохи більше та вимірюють поглинання проти “холостої” проби (замість білку прилити рівний обєм води) при 750 нм (червоний світлофільтр), кювета 5 мм. Знаходять концентрацію білку за калібрувальною кривою.

Література

1. Практическая химия белка. Перевод с англ.. под ред. А.Добре.-М.: Мир, 1989, 623 с.

Лабораторна робота №3

(4 години)

Тема: Кількісне визначення амінокислот методом розподільної хроматографії на папері

Мета роботи: Вивчити хроматографічний метод кількісного визначення амінокислот з використанням розподільної хроматографії на папері.

Теоретичні відомості

Для хроматографічного розподілу суміші амінокислот та їх кількісного визначення часто застосовується метод розподільної хроматографії на папері, запропонований у 1944 р. Мартіном і Сінджем, який базується на розподілі речовин рухомої фази відносно нерухомого носія в залежності від їх спорідненості з носієм. Амінокислоти можуть бути розподілені між двома рідкими фазами, що не змішуються, в таких системах як фенол-вода або н-бутанол-вода. Розчинені амінокислоти розподіляються між рівними обємами двох рідин. Відношення концентрацій амінокислоти в цих двох рідких фазах у стані рівноваги при даній температурі називається коефіцієнтом розподілу. Кожна амінокислота має характерний тільки для неї коефіцієнт розподілу, що відповідає даній парі розчинників.

Суміш амінокислот з різними коефіцієнтами розподілу можна кількісно розподілити при хроматографії на папері між двома рідкими фазами, що не змішуються, при чому процес розподілу багаторазово повторюється під час руху суміші що розділяється вздовж тонкого шару паперу. Якщо одна речовина з низьким коефіцієнтом розподілу Z рухається по хроматографічному папері швидше ніж речовина Y, що має більш високий коефіцієнт розподілу, то через деякий час ці речовини повністю розділяться, При цьому спостерігається тенденція до концентрації кожної речовини в певному місці у вигляді плями.

В якості носія нерухомої фази використовується чиста целюлоза у вигляді спеціального фільтрувального паперу, який повинен бути особливо чистим та мати дуже рівномірно розподілену щільність. Целюлоза, з якої складаються волокна фільтрувального паперу, що застосовується в хроматографії, знаходяться в гідратованому стані. Протягом часу, коли розчинник, що містить суміш амінокислот, піднімається під дією капілярних сил по бумазі, закріпленій вертикально, проходить безліч мікроскопічних актів розподілення амінокислот між рухомою фазою та стаціонарною фазою, яка повязана з волокнами бумаги. В кінці цього процесу різні амінокислоти проявляються на різній відстані від старту.

Хроматографічне розділення суміші амінокислот на папері можна проводити послідовно в двох напрямках на квадратному листку хроматографувального паперу з використанням двох різних систем розчинників. В такому випадку одержуємо двовимірну карту розташування різних амінокислот.

Існує кілька різновидів хроматографічного паперу, який відрізняється товщиною та щільністю:

• папір № 1 та 2 менш щільний і називається "швидким";

• папір № 3 і 4 — "повільним".

Звичайні сорти паперу гідрофільні і містять до 20-22 % вологи. Тому при використанні води як нерухомої фази ніякого спеціального зволоження паперу не потрібно.

Метод розподільної хроматографії на папері застосовуєтся для кількісного визначення амінокислот після їх хроматографічного розділення на папері.

Основа методу — реакція амінокислоти з нінгідрином у слабокислому середовищі з подальшим перетворенням отриманого в результаті реакції нестійкого синьо-фіолетового похідного — дикетогідринделідендикетогідрин-диамін (ДІДА) в стабільне похідне міді оранже­во-червоного кольору, яке має максимум поглинання при 530 нм. Кількісне визначення амінокислот базується на вимірюванні оптичної густини Cu-похідного ДІДА після його вимивання з паперу. Лінійна залежність між вмістом амінокислот у плямі та оптичною густиною забарвлення залишається між 0,025 та 0,25 мкмоль амінокислоти.

Метод застосовується для визначення всіх амінокислот, за ви­нятком проліну і оксипроліну, які інакше реагують з нінгідрином і утворюють мідне похідне іншої будови.

За допомогою даного методу можливе кількісне визначення вільних амінокислот у білкових гідролізатах та біологічних рідинах (кров, сеча, екстракти тканин).