Векторы для клонирования.

Вектором в генетической инженерии называют молекулу ДНК, способную самостоятельно реплицироваться, включать в свой состав чужеродную ДНК, переносить ее в реципиентные клетки и стабильно там поддерживать. Векторы используют для создания in vitro рекомбинантных молекул ДНК, чтобы впоследствии ввести их в клетки, для последующего клонирования там, то есть умножения их количества. Репликация векторов зависит от клеточных белков, поэтому для каждого вида реципиентных клеток необходимо конструировать свои векторы.

Обычно в качестве векторных молекул используют ДНК плазмиды и вирусы, в том числе фаги, предварительно их модифицируя.

Классификация векторов.

По области использования различают: 1) векторы общего назначения – для клонирования геномных генов, кДНК и любых фрагментов ДНК; 2) векторы для экспрессии клонированных генов – для синтеза мРНК и белков; 3) специализированные векторы – для секвенирования генов и мутационного анализа, для изучения особенностей регуляции клонированных генов, для идентификации в клонируемой ДНК промоторов и других регуляторных сайтов.

По происхождению векторы делят на: 1) плазмидные, которые существуют в клетке и вне ее только в виде молекул ДНК; 2) фаговые, которые существуют в виде молекул ДНК и вирионов; 3) гибридные, которые сочетают отдельные свойства плазмид и фагов. К гибридным векторам, в свою очередь, относят: а) фагмиды, представляющие собой плазмидные векторы, содержащие ori-сайт нитевидных фагов; б) космиды, представляющие собой автономные cos сайды, по которым происходит упаковка фага λ; в) фазмиды, представляющие собой вектора, в которых сочетаются положительные свойства фаговых и плазмидных векторов.

По структуре ДНК различают кольцевые и линейные векторы.

По способу поддержания в клетке выделяют: 1) автономные векторы, которые реплицируются самостоятельно; 2) интегративные векторы, которые реплицируются в составе клеточной хромосомы.

По числу молекул в клетке векторы могут быть малокопийными и мультикопийными.

По числу репликаторов, имеющихся в векторном геноме, векторы делят на моно и бирепликоновые. Бирепликоновые векторы также называют челночными, если они могут реплицироваться в клетках различных видов.

Свойства векторных молекул.

Для эффективного выполнения своей функции вектор должен отвечать следующим требованиям: 1) быть репликоном, чтобы стабильно существовать в клетке; 2) иметь селективный маркер, позволяющий отбирать трансформированные вектором клетки; 3) иметь по крайне мере один единичный сайт рестрикции, или сайт клонирования, для внедрения в него чужеродной ДНК.

Дополнительные свойства определяются целью клонирования генов. Так векторы, предназначенные для экспрессии генов, должны содержать мощные промоторы. Малокопийные векторы позволяют изучать механизмы регуляции клонируемых генов, а мультикопийные способны амплифицировать их число в тысячи раз. Векторы прямой селекции позволяют выживать только таким трансформантам, которые седержат рекомбинантную ДНК.

Стратегия выбора векторной молекулы.

Выбор вектора определяется целью клонирования и условиями эксперимента. Преимущества небольших плазмидных векторов заключаются в том, что: 1) их карты рестрикции относительно просты, что увеличивает вероятность наличия в них единичных сайтов узнавания для конкретных рестриктаз и значительно облегчает составление подобных карт у клонируемых фрагментов.; 2) такие молекулы ДНК более устойчивы к повреждениям при манипуляции ими in vitro; 3) они как правило мультикопийны; 4) имеется бОльшая вероятность обнаружения рекомбинантной ДНК с помощью различных зондов в процедуре скрининга методом гибридизации, поскольку с повышением размера плазмид уменьшается их копийность, что ослабляет сигнал детекции.

По этим причинам плазмидные векторы используют для клонирования небольших фрагментов ДНК, так что размер рекомбинантной ДНК обычно не превышает 10-15 т.п.н.

Для увеличения количества сайтов клонирования в плазмиды вводят полилинкеры, представляющие собою синтетические олигонуклеотиды, содержащие необходимое число сайтов рестрикции.

Фаговые векторы конструируют на базе ДНК фагов с таким расчетом, чтобы в них сохранилась информация, которая обеспечивает сборку in vivo фаговых частиц, и чтобы имелась возможность упаковывать рекомбинантную ДНК в фаговые головки. Некоторые такие векторы и рекомбинантные ДНК, сконструированные на их основе, можно упаковывать in vitro в капсиды, что значительно увеличивает эффективность их введения в реципиентные клетки. Фаговые векторы позволяют клонировать гены, продукты которых токсичны для клетки, так как они не оказывают вредного действия на фаг. Фаговые векторы и фаговые рекомбинантные ДНК относительно легко выделяются из клеток без примеси бактериальной ДНК, поскольку при этом они находятся в составе фаговых частиц.

Для клонирования больших фрагментов ДНК используют векторные молекулы с большой емкостью. Такими являются искусственная хромосома дрожжевых клеток – YAC, векторы на основе ДНК плазмидных профагов P1 – PAC и N1 – NAC, а также F-плазмиды (BAC).

Методы отбора гибридных клонов.

Смесь молекул, полученных после встройки в выбранный вектор фрагментов чужеродной ДНК, вводят в реципиентрые клетки. Если при этом в вектор статистически встраивают большой набор разных фрагментов ДНК, то вероятность встройки каждого конкретного фрагмента невелика. В этом случает используют набор методов, позволяющие в большом многообразии получаемых гибридных клонов выявлять необходимые.

Фенотипическая селекция при отборе гибридных клонов.

При трансформации клеток чаще всего используют векторные молекулы ДНК, несущие гены устойчивости к антибиотикам и антиметаболитам. Поэтому в среде с определенным антибиотиком и антиметаболитом будут расти только трансформированные клетки. Если векторная плазмида определяет устойчивость к двум антибиотикам и при встройке в нее чужеродного фрагмента ДНК нарушается одна из генетических детерминант устойчивости к антибиотикам, то клоны клеток, содержащие такие рекомбинантные ДНК, легко отличить от трансформантов, включающих исходный вектор, на средах с каждым антибиотиком в отдельности.

Внедрение чужеродных фрагментов в состав ДНК вирусов обычно приводит к повреждению определенных вирусных генов, а часто возможно лишь при выщеплении сегмента вирусной ДНК. Поэтому рекомбинантные вирусы как правило являются мутантными. Обычно используют такие варианты клонирования, при которых формируемый мутантный вирус жизнеспособен.

Гибридизация нуклеиновых кислот in situ при отборе гибридных клонов.

Основной недостаток методов фенотипического выявления гибридных клонов празмид и вирусов заключается в отм, что с их помощью не удается отобрать гибриды, содержащие специфические последовательности ДНК. Такие последовательности легко выявить методами гибридизации НК in situ в колониях трансформированных клеток.

Колонии бактерий, выросшие после трансформации их плазмидной ДНК, перепечатывают на нитроцеллюлозный фильтр, который помещают в чашку на агаризованную питательную среду и инкубируют до появления на нем колоний клеток. Расположение колоний на фильтре соответствует их расположению на матричных чашках. Клетки в колониях на фильтре лизируют в условиях, вызывающих денатурацию ДНК. Затем на обработанных фильтрах проводят гибридизацию адсорбировавщейся ДНК исследуемых клонов с радиоактивно-меченным препаратом целевой ДНК. Клоны, в которых произошла гибридизация НК, обнаруживаются радиоавтографически. Соответствующие бактериальные клоны с матричных чашек переносят в питательную среду и наращивают.

Функциональная комплементация при отборе гибридных клонов.

Большой интерес для генетической инженерии представляет достижение правильной экспрессии клонированной генетической информации в клетках-рецепиентах. Экспрессию легко выявить, если клонируемых ген при правильной транскрипции и трансляции обеспечивает функциональную комплементацию мутаций генома клетки. В этом случае нужный гибрид может быть обнаружен простым отбором трансформированных клонов на селективной среде.

Радиоиммунноанализ белков in situ при отборе гибридных клонов.

Данный метод используется для поиска клонов гибридов при экспрессии генов высших эукариот и их вирусов в бактериальных клетках. В основе методы положена способность молекул иммуноглобулинов связываться с полистиролом или поливинилом. Кроме того, предполагается, что исследуемых белок имеет не менее двух антигенных детерминант и может связывать по крайне мере две разные молекулы иммуноглобулинов, присутствующие в препарате поликлональных антител, полученных на целевой белок. Колонии трансформантов перепечатывают идентичным образом на две чашки с агаризованной питательной средой и чашки инкубируют до получения колоний необходимого размера. Затем на одной их чашек лизируют бактериальные клетки и прижимают к поверхности среды поливиниловый диск с адсорбированными на нем специфическими антителами. При этом на диске происходит иммуносорбция антигена. После промывания диска на него наносят меченные йодом 125 антитела к белку искомого гена. Колонии, в которых образовался комплекс антиген-антитело, выявляют радиоавтографически. Из соответствующих колоний с матричных чашек бактерии пересевают на питательные среды и проводят анализ содержащихся в них гибридных плазмид.

Библиотеки.

Библиотека – набор клонов, каждый из которых содержит векторную молекулу различных фрагментов ДНК, производных от общей ДНК или РНК клеток или ткани. Если коллекция клонов достаточно велика, теоретически она должна содержать всю последовательность оригинальной ДНК. Затем можно идентифицировать в библиотеке клон, несущий интересующий фрагмент ДНК, используя чувствительные скрининговые методы, способные обнаружить его в коллекции из миллионов различных фрагментов, называемых библиотекой.

Геномные библиотеки.

Один полезный тип библиотек содержит набор фрагментов геномной ДНК, генерируемой с помощью умышленно ограниченного количества рестриктазы, разрезающей ДНК в точках, часто встречающихся в геноме. Вследствие использования малого количества фермента случайным образом расщепляются не все, а только некоторые сайты распознавания фермента. Метод генерирует набор перекрывающихся фрагментов, пригодных для клонирования в векторы. Например, плазмиды, специально разработанные для создания BAC, подготавливают так, чтобы в вектор могли быть перенесены сгенерированные при частичной рестрикции фрагменты ДНК человека размером от 100 до 350 т.п.н. После того как рекомбинантные плазмиды, содержащие большие фрагменты ДНК человека, внесли в бактерии, библиотека, содержащая много тысяч клонов, каждый из которых содержит различные фрагменты, частично перекрывающие геномную ДНК, может храниться для последующего выделения многих генов. Если библиотека достаточно велика, каждый сегмент генома будет представлен по крайне мере на одном из перекрывающихся фрагментов.

Библиотеки комплементарной ДНК.

Другой распространенный тип библиотек, используемый для выделения последовательностей генов – библиотеки кДНК, содержащие мРНК конкретной ткани. Как источник клонирования генов для некоторых приложений комплементарные последовательности ДНК предпочтительнее геномных библиотек, поскольку:

1. кДНК содержит только экзоны гена, и следовательно, прямое представление кодирующей последовательности гена без интронов и промотора.

2. комплекты кДНК, представляющие копии одного гена, могут отличаться, что указывает на наличие альтернативных промоторов, или точек полиаденилирования, или различных точек сплайсинга, так что некоторые экзоны могут или включаться, или исключаться из некоторых копий.

3. Использование конкретного источника мРНК в значительной степени увеличивает число копий известного гена, выборочно экспрессированного в этой ткани.

Клонирование кДНК происходит с участием фермента обратной транскриптазы. Полученная единичная нить кДНК служит шаблоном для ДНК-полимеразы, преобразующей однонитевую молекулу в двухнитевую спираль. Ее используют в подходящем векторе для создания библиотеки кДНК, представляющей все исходные копии мРНК, обнаруженные в начальном типе клеток или ткани. Созданы тысячи библиотек кДНК из различных тканей или одних и тех же тканей, взятых на разных стадиях развития многих организмов.

Направленный мутагенез молекул ДНК

Для генетического анализа какого-либо вида организмов необходимо выявление мутантов с определенными физиологическими дефектами. До недавнего времени такие мутанты получали в результате отбора организмов из популяции, подвергшихся случайному, ненаправленному мутагенезу. В настоящее время имеется возможность вводить в изолированный ген заранее запланированные мутации. Такие исследования проводят в двух направлениях: 1) сегмент-направленный мутагенез, являющийся статистическим мутагенезом, действие которого определенным образом ограничено лишь выбранным районом молекулы ДНК; 2) сайтспецифический мутагенез, под которым подразумевают введение предопределенных мутаций в заранее запланированное место мзучаемого фрагмента ДНК.

Генно-инженерные делеции и вставки последовательностей ДНК.

Самый простой вариант получения делеций – расщепление молекулы ДНК рестриктазой, которая имеет на ней более одного участка узнавания, с последующим лигированием полученного препарата ДНК. При этом часть образуемых молекул будет укорочена вследствие выщепления одного или нескольких рестрикционных фрагментов.

Второй распространенный вариант введения делеций в кольцевые двухцепочечные ДНК in vitro заключается в том, что ДНК расщепляют в определенном месте рестиктазой и образовавшуюся линейную молекулу обрабатывают нуклеазой Bal31, которая гидролизует молекулу ДНК с обеих концов, деградируя одновременно обе цепи. В результате можно получить одновременно набор укороченных линейных молекул, которые после циклизации в лигазной реакции формируют соответствующий набор кольцевых ДНК с делециями.

Для встройки в ДНК использую природные фрагменты ДНК или синтетические линкеры. Случайные двухцепочечные разрывы можно вводить в молекулы ДНК путем кратковременного воздействия на них небольшого количества панкреатической ДНКазы I в присутствии катионов Mn²⁺. Получить молекулы ДНК с одиночными разрывами в разных местах можно, обрабатывая их рестриктазой, имеющей много участков узнавания на данном субстрате, так чтобы каждая молекулы ДНК гидролизовалась в среднем лишь по одному участку.

Статистический мутагенез гибридных ДНК.

Высокая эффективность мутагенеза достигается при использовании гидроксиламина и в еще большей степени его производных типа О-метилгидроксиламин. Большим достоинством данных мутагенов является детальная изученность механизма их действия на НК. Они обладают высокой специфичностью и взаимодействуют в основном с цитозином и на два порядка менее эффективно с аденином. При этом более сильным мутагеном является О-метилгидроксиламин, поскольку продукт его реакции с цитозином имеет в основном кетоформу, спаривающуюся с аденином, в то время как аналогичный продукт гидроксиламина N-4-гидроксицитозин находится в кето и енольной формах в соотношении примерно 1:1. О-метилгидроксиламин как и гидроксиламин атакует те азотистые основания, плоскости которых не экранированы соседними. Для кольцевой плазмидной молекулы это возможно лишь в участках локальной денатурации двухспиральной структуры ДНК. На скорость модификации цитозина под действием О-метилгидроксиламин существенное влияние оказывает pH раствора.

Сайт-специфичный мутагенез.

Суть методы заключается в изменении конкретного нуклеотида в последовательности. Для его использования сначала необходимо клонировать этот ген в плазмиде. После этого проводят ПЦР с одним праймером. Причем этот праймер должен как раз включать в себя последовательность, которую мы хотим изменить — уже в нужном виде. Например, вместо аденина, который должен был бы стоять напротив Т в родительской цепи, в праймере стоит Ц. После синтеза второй цепи ДНК плазмиды, содержащей праймер, в нее будет внесена мутация — А заменится на Ц. Такие плазмиды вводятся в клетки, в которых при делении две цепи окажутся в разных дочерних клетках. Таким образом, в половине клеток-потомков будет изначальный вариант плазмиды, а в половине — мутантный. Тогда, соответственно, половина клеток будет производить нормальный белок, кодируемый этим геном, а половина — мутантный.