Лекция 1. Молекулярно-генетические методы.

Эти методы позволяют анализировать фрагменты ДНК, находить и изолировать отдельные гены и их сегменты и устанавливать в них последовательность нуклеотидов.

Выделение НК

Все современные методы очистки нуклеиновых кислот можно разделить на две большие группы: методы с поэтапным удалением примесей из водного раствора НК и методы, основанные на сорбции НК на твердой фазе.

Наиболее известной методикой первого типа является, пожалуй, фенол-хлороформная экстракция (СЛАЙД 2, 3). Стандартной и ставшей уже классической считается методика получения чистого препарата НК, предложенная Marmur. Она включает в себя ферментативный протеолиз клеток с последующей депротеинизацией и осаждением НК спиртом. Еще один метод из этой группы основан на использовании ионообменников типа Chelex TM (Bio-Rad, США), которые, в отличие от оксида кремния, сорбируют не НК, а примеси, мешающие реакции ПЦР (СЛАЙД 4, 5). Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца, в результате чего клеточные стенки разрушаются, а НК выходят в раствор; и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения.

Вторая группа методик основана на использовании силикатных сорбентов, эффективно связывающих НК в растворе с высокой ионной силой (например, наборы фирмы QIAGEN) (СЛАЙД 6). Одной из первых предложенных методик такого типа является метод выделения ДНК Boom с соавторами (Boom et al., 1990; 1999). Этот метод основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента – гуанидина тиоционата (GuSCN) и последующей сорбции ДНК на твердом носителе (сейчас основанные на оксиде кремния сорбенты можно встретить под названием «стеклянные бусы», «диатомовая земля», «стеклянное молоко» и др.). После промывки сорбента на нем остается чистая НК, легко снимающаяся дистиллированной водой. В последнее время чрезвычайно распространены одноразовые пластиковые микроколонки с упакованным в них сорбентом. Промывка колонок раствором с высокой ионной силой удаляет белки и низкомолекулярные соединения, после чего проводят элюцию очищенных НК путем промывания частиц растворами с низкой ионной силой (СЛАЙД 7).

Также в настоящее время на рынке имеются автоматические станции для выделения НК (СЛАЙД 8).

Визуализация НК

Наиболее простой метод – электрофорез. Электрофорез - движение частиц, находящихся во взвешенном состоянии в жидкой или в газообразной среде, под действием внешнего электрического поля.

Электрофорез НК – это метод разделения фрагментов НК по их длине и форме. Когда говорят об электрофорезе НГ, обычно имеют в виду гель-электрофорез. Обычно применяется для визуализации выделенной геномной ДНК, продуктов амплификации после полимеразной цепной реакции, а также разделения рестрикционных фрагментов (СЛАЙД 9).

Электрофорез проводится в камере, заполненной буферным раствором. Чаще всего используются буферы, содержащие ЭДТА, трис и борную кислоту TAE и TBE. Буфер необходим для повышения ионной силы раствора, в котором будет происходить разделение молекул НК под действием приложенного электрического поля. Созданное электрическое поле, действующее на фрагменты НК, заставляет их мигрировать через гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее. Для электрофоретического анализа ДНК обычно используют агарозные (для относительно длинных молекул ДНК) и полиакриламидные (для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, в случае секвенирования) гели (СЛАЙД 10-16). Для того чтобы было видно какое количество НК раскапывается, в раствор НК вносится синька. Она также позволяет визуально отслеживать процесс движения НК сквозь гель (СЛАЙД 17). Средняя концентрация геля обычно составляет 1% - то есть на 100 мкл буфера кладется 1 грамм агарозы.

После разделения (иногда краситель вносят в расплавленную агарозу) фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флуоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флуоресцирует в УФ-лучах (СЛАЙД 18, 19, 20).

Определение размеров производят путем сравнения коммерчески доступных фрагментов ДНК (DNA ladder, «линейка»), содержащих линейные фрагменты ДНК известной длины с фрагментами, полученными в ходе эксперимента (СЛАЙД 21).

В настоящее время известно множество вариаций на тему электрофорез нуклеиновых кислот, однако все они направлены на выполнение специфических задач. На данном курсе мы не будем их все рассматривать. Предлагаю вам сделать это самостоятельно, открыв любой сборник методов генной инженерии, либо набрав в интернете «методы электрофореза нуклеиновых кислот». Однако, далее, я хотел бы все же остановиться на таком методе как капиллярный электрофорез ДНК, благодаря которому происходит разделение коротких фрагментов ДНК.

Метод капиллярного электрофореза (КЭ) основан на разделении компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля. Микрообъем анализируемого раствора вводят в капилляр, предварительно заполненный подходящим буфером – электролитом. После подачи к концам капилляра высокого напряжения (до 30 кВ), компоненты смеси начинают двигаться по капилляру с разной скоростью, зависящей в первую очередь от заряда и массы и, соответственно, в разное время достигают зоны детектирования. Полученная последовательность пиков называется электрофореграммой, при этом качественной характеристикой вещества является параметр удерживания (время миграции), а количественной – высота или площадь пика, пропорциональная концентрации вещества. Метод капиллярного электрофореза позволяет разделять НК до 1 нуклеотида (СЛАЙД 22, 23).

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой метод ферментативной наработки in vitro определенных, сравнительно коротких, двухцепочечных фрагментов ДНК (СЛАЙД 24). В основе реакции лежит механизм, который в природе реализован при внутриклеточном удвоении (репликации) молекул ДНК ферментов ДНК-полимеразой. Для протекания реакции необходимы следующие ключевые компоненты:

1. Исходная молекула ДНК, служащая матрицей для репликации

2. Фермент ДНК-зависимая-ДНК-полимераза

3. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты

4. Короткие одноцепочечные ДНК-затравки, или праймеры

Если эти компоненты смешать в соответствующем солевом растворе (буфере), ДНК-полимераза будет синтезировать ДНК из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, подставляя их по принципу комплементарности к матричной молекуле ДНК начиная от ДНК-затравки. При проведении ПЦР используют, как правило, два праймера, взаимодействующих (гибридизующихся) в соответствии с принципом комплементарности с противоположными цепями ДНК и ограничивающих участок матричной молекулы, который будет амплифицирован в ходе реакции.

Классическая ПЦР состоит из повторяющихся температурных циклов, состоящих, в свою очередь, из трех температурных режимов:

1. Разрушение водородных связей между цепями ДНК (93-96 °С), или денатурация;

2. Гибридизация праймеров на ДНК (40-75 °С), или отжиг;

3. Синтез комплементарных цепей ДНК путем удлинения праймеров (60-75 °С), или элонгация (СЛАЙД 25, 26, 27, 28).

В результате повторения циклов ПЦР, увеличение ограниченного праймером фрагмента ДНК идет в геометрической прогрессии, поскольку ранее синтезированные фрагменты на каждом цикле реакции выступают в качестве матриц для синтеза новых фрагментов. Как правило, для получения достаточного для детекции количества ДНК, в зависимости от начальной концентрации матриц и эффективности реакции, необходимо от 20 до 50 циклов ПЦР (РОЛИК ПРО ПЦР).

Праймеры для ПЦР:

1. Длина 18-24 нуклеотида;

2. Четыре и более 3΄-концевых нуклеотида не должны быть комплементарны самому праймеру, праймеру в паре, пробе или иным синтетическим олигонуклеотидам, добавляемым в реакцию;

3. Температура отжига должна лежать в диапазоне 60-70 °С;

4. Температура «правления» праймеров, работающих в паре, должна быть сходной;

5. Желательно, чтобы температура плавления 5΄-концевой части праймера была выше температуры плавления 3΄-концевой части;

6. С 5΄-конца праймера может быть добавлена не комплементарная матрице последовательность практически любой длины.

Полимеразы для ПЦР

Основное требование к полимеразе, используемой в ПЦР, – способность сохранять активность после инкубации при 95 °С.

Taq-полимераза была выделена из термофильной эубактерии Thermus aquaticus. Фермент представляет собой одну полипептидную цепь с молекулярной массой 95 кДа. Это высокопроцессивный фермент (как правило, эффективно амплифицирующий фрагменты длиной до 3-5 тысяч пар нуклеотидов) с хорошо выраженной 5΄→ 3΄ экзонуклеазной активностью и без 3΄→ 5΄ экзонуклеазной активности. Получаемые при использовании Taq-полимеразы фрагменты ДНК, как правило, содержат выступающий 3΄ -концевой нуклеотид, чаще всего А, нематрично присоединяемый ферментом.

Pfu-полимераза получена из Pyrococcus furiosus. Масса фермента около 92 кДа. Это низкопроцессивный фермент с хорошо выраженной 3΄→ 5΄ экзонуклеазной активностью.

Большинство коммерческих ферментов представляют собой смеси нескольких полимераз с различными свойствами. Для получения высокопроцессивного и высокоточного фермента чаще всего смешивают Taq-полимеразу и Pfu-полимеразу.

Программы амплификации.

Классическая программа состоит из трех режимов: денатурация, отжиг и элонгация.

Первоначальный прогрев реакционной смеси. Часто при проведении ПЦР советуют прогреть смесь при 90-95 °С в течение 1-3 минут. Этот шаг нужен для того, чтобы температура всей системы (термоблок, пробирка и реакционная смесь) наверняка достигла 90 °С, а также, отчасти, для лучшего перемешивания компонентов.

Денатурация ДНК. Чтобы полностью денатурировать ДНК, достаточно одной секунды инкубации при температуре 90 °С. Для большинства современных амплификаторов с датчиком измерения температуры в конкретной пробирке рекомендуется 5-10 секунд инкубации для уверенной денатурации ДНК.

Отжиг праймера. В литературе встречаются два разных понятия: температура плавления и температура отжига. Под температурой плавления олигонуклеотида (денатурации или гибридизации олигонуклеотида) обычно понимают температуру, при которой половина молекул гибридизована (находится в двухцепочечном состоянии), а половина находится в растворе. Данный параметр является характеристикой олигонуклеотида для конкретных условий среды. Под температурой отжига принято понимать оптимальную температуру соответствующего режима в программе амплификации. Температура отжига в отличие от температуры плавления является характеристикой реакционной системы в целом в зависимости от требуемого результата ПЦР.

Очевидно, что параметры температуры отжига и температуры плавления связаны, однако точной формулы расчета этого отношения не существует, поскольку температура отжига, в отличие от температуры плавления, зависит и от поставленной задачи. Тем не менее, в первом приближении, можно сказать, что для большинства приложений верным будет соотношение: температура отжига = температура плавления – 5.

Удлинение праймеров. Стандартная температура элонгации при использовании Taq-полимеразы дикого типа составляет 68-72 °С. Считается, что при этом скорость работы фермента составляет примерно 50-100 нуклеотидов в секунду. При этой температуре для эффективной амплификации фрагмента в несколько сотен тысяч пар нуклеотидов обычно достаточно 5-30 секунд элонгации. Однако фермент достаточно хорошо работает и при более низких температурах, вплоть до комнатной. Поэтому, если температура отжига праймеров в данном эксперименте выше 60 °С, нет необходимости добавлять отдельный температурный интервал для синтеза ДНК. Вполне достаточно увеличить время инкубации на этапе отжига праймеров. Использование таких двухстадийных циклов позволяет существенно сократить время прохождения ПЦР, поскольку именно на температурные переходы уходит большая часть времени протекания реакции.

Число циклов ПЦР. При максимальной эффективности реакции достаточно 38-40 циклов для получения 25-50 нг/мкл продукта амплификации с единственной исходной молекулы ДНК, попавшей в пробирку. Но вообще, число циклов программы амплификации зависит от поставленной задачи, эффективности реакции и количества ДНК-матриц на старте реакции.

Окончательная достройка цепей. По окончании ПЦР иногда полезно достроить одноцепочечную фракцию ДНК, как правило, составляющую значительную часть продуктов реакции. Для достройки одноцепочечной фракции пробирки после ПЦР инкубируют при 72 °С в течение 5-10 минут или проводят несколько циклов ПЦР без денатурации (72 °С – 5 минут, 60 °С – 1 минута).

Хранение пробирок в приборе после ПЦР. Часто можно наблюдать добавление в конце программы амплификации этапа «бесконечного» хранения пробирок при 4-10 °С. Объективных причин использования такого приема нет, поскольку и при комнатной температуре продукт амплификации может храниться сколь угодно без заметных изменений. Вместе с тем, использование хранения после амплификации ведет к повышенной нагрузке на прибор и неоправданному расходу электроэнергии (СЛАЙД 29, 30).

Полимеразная цепная реакция в реальном времени.

В начале 90-х годов прошлого столетия было предложено регистрировать накопление ДНК непосредственно в ходе ПЦР. При регистрации накопления продуктов амплификации на протяжении всего процесса, исследователь получает гораздо больше информации об особенностях реакции. Зная кинетику процесса, можно уже оценивать начальные параметры реакции и сравнивать реакции между собой.

Все существующие в настоящее время системы регистрации накопления продуктов ПЦР непосредственно во время реакции основаны на измерении флуоресценции реакционной смеси. Причем системы «проявки» ДНК разрабатывались так, чтобы интенсивность флуоресценции была пропорциональна количеству наработанной в ходе реакции ДНК (СЛАЙД 31, 32).

Способные к флуоресценции молекулы – флуорофоры – поглощают свет одной длины волны и испускают свет другой, большей длины волны. Длины волн поглощения и испускания, а также количество поглощенного и испущенного света являются характеристикой каждого из флуорофоров и могут существенно различаться для разных соединений, что позволяет независимо детектировать сразу несколько флуорофоров в смеси. Большинство флуоресцирующих соединений, используемые в ПЦР в реальном времени, представляют собою гетероциклические и полиароматические углеводороды. Когда говорят о взаимодействии различных флуоресцирующих соединений, под гашением обычно понимают любой процесс, ведущий к уменьшению квантового выхода данного процесса флуоресценции. Соединения, оказывающие влияние на флуоресценцию других соединений, называются гасителями.

Аллель-специфические праймеры в ПЦР в реальном времени.

Для идентификации аллелей проводят ПЦР с праймерами, каждый из которых полностью совпадает только с одним из вариантов последовательности. Вариабельный нуклеотид располагают в 3’-концевой части аллель-специфичного праймера. Условия реакции подбирают так, чтобы максимизировать разницу в эффективности удлинения «правильно» и «неправильно» гибридизованного праймера (СЛАЙД 33).

«Амплифлюр» (Amplifluor), «санрайз» (Sunrise)

В данном варианте метода аллель - специфичные праймеры несут на 5’ конце адаптерную последовательность, способную формировать шпилечную структуру (типа стебель-петля). Адаптеры несут флуоресцентные метки и гасители флуоресценции, расположенные так, что при образовании шпилечной структуры флуорофор и гаситель оказываются сближены. В растворе праймеры сохраняют структуру шпильки, имеющую низкий уровень флуоресценции. В ходе реакции шпилька раскрывается (поскольку меченый праймер становится частью двухцепочечного продукта), что приводит к усилению сигнала. Описан вариант метода, в котором гаситель находится на отдельном олигонуклеотиде, комплементарном 5’-концевой адаптерной последовательности. В этом случае при встраивании праймера в ДНК гибридизация с гасящим олигонуклеотидом оказывается невозможной (СЛАЙД 34).

Аллель-специфичные праймеры-«скорпионы»

В данном подходе разработчики постарались обойти проблему детекции неспецифических продуктов реакции, объединив аллель-специфичный праймер с гибридизационной пробой. Для этого они использовали праймеры типа «амплифлюр», в которых петлевая часть адаптерной шпильки комплементарна внутренней части образующегося фрагмента. Во избежание «простройки» адаптера, его отделили от праймера блокатором синтеза второй цепи ДНК. Таким образом, после образования продукта реакции, петлевая часть адаптерной последовательности «скорпиона» гибридизуется на внутреннюю часть фрагмента, что ведет к разобщению флуорофора и гасителя и возрастанию флуоресценции (СЛАЙД 35).

Дифференциация аллелей с помощью олигонуклеотидных проб.

Во всех методах данного типа разделение аллелей основано не на эффективности удлинения аллель-специфичных праймеров, а на эффективности гибридизации аллель-специфичных олигонуклеотидных проб на содержащий полиморфизм продукт ПЦР. Иными словами, полиморфный нуклеотид входит в структуру пробы, а не праймера.

Продукт ПЦР в данном случае получают с использованием общей для всех аллелей пары праймеров, а в реакционную смесь добавляют столько аллель-специфичных проб, сколько аллелей необходимо различить (при этом каждая проба помечена своим флуорофором и полностью комплементарна лишь «своему» аллелю). Для простоты ниже приведено описание механизма работы только одной из аллель-специфичных проб, добавляемых в реакцию.

Проба обычно представляет собой короткий (10-40 н.п.), блокированный от удлинения с 3’-конца, олигонуклеотид, несущий метку. В качестве меток, также как и в случае мечения праймеров, можно использовать любые детектируемые по отдельности соединения, однако в последнее время наибольшее применение получили флуоресцирующие агенты.

«Вытесняющие пробы» (displacing probe)

В данном подходе используют пробу, представляющую собой пару частично комплементарных друг другу олигонуклеотидов, один из которых несет флуорофор, а другой – гаситель флуоресценции. В отсутствие мишени проба образует дуплекс, в котором флуоресценция подавлена. При накоплении соответствующего пробе продукта реакции, процесс реассоциации пробы начинает конкурировать с процессом отжига олигонуклеотидов на мишень, что ведет к увеличению уровня флуоресценции. Структуру пробы и условия реакции подбирают таким образом, чтобы наиболее термодинамически выгодной была гибридизация на «правильный» аллель. Следующее по стабильности состояние – двуцепочечная проба. Отжиг пробы на «неправильный» аллель наименее выгоден (СЛАЙД 36).

«Разрушаемая проба» («такман», TaqMan)

Содержащую полиморфизм пробу метят флуорофором и гасителем флуоресценции (используя как концевое, так и внутреннее мечение). В отсутствие мишени флуорофор и гаситель сближены и флуоресценция подавлена. При накоплении соответствующего продукта реакции, проба гибридизуется на ПЦР-фрагмент, что ведет к ее разрушению за счет 5’-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы. Интенсивность сигнала возрастает с каждым циклом ПЦР пропорционально накоплению ампликонов (СЛАЙД 37).

«Молекулярные маячки» (Molecular beacons)

Вариантом предыдущей технологии является использование проб, несущих инвертированный концевой повтор. Флуорофор и гаситель располагают по концам молекулы. Негибридизованные пробы, находящиеся в растворе, образуют структуру типа стебель-петля с низким уровнем флуоресценции. Гибридизованная на матрицу проба «разворачивается», что ведет к существенному повышению уровня флуоресценции. Использование «маячков», за счет хорошего контакта флуорофора и гасителя, несколько повышает разнообразие флуорофоров, возможных для детекции в одной пробирке (СЛАЙД 38).

«Примыкающие пробы» (adjacent probes, kissing probes)

В методике используют два олигонуклеотида, гибридизующихся на матрицу рядом. Один из олигонуклеотидов несет флуорофор-донор (олигонуклеотид-донор), другой – флуорофор-акцептор (олигонуклеотид-акцептор). Гибридизация двух олигонуклеотидов на матрицу ведет к переносу энергии с флуорофора-донора на флуорофор-акцептор (по механизму флуоресцентно-резонансного переноса энергии, FRET) (СЛАЙД 39).

Биочипы.

В настоящее время для массового скрининга сразу на множество мутаций ДНК используют чиповые технологии (СЛАЙД 40). Главным элементов биочипов, или микроэрреев, является матрица ячеек, размером от 10 до 100 микрон, каждая из которых содержит молекулярные зонды, специфичные к одной из множества биологических молекул или их фрагментов (например, последовательностям ДНК или РНК, белкам). Такими зондами могут служить олигонуклеотиды, фрагменты геномной ДНК, РНК, белки рецепторы антител, лиганды, олигосахариды.

В матричных молекулярных биочипах ячейки с иммобилизованными зондами расположены рядами M x L ячеек, причем в каждой отдельной ячейке иммобилизованы зонды с определенной специфичностью. Общее число ячеек на чипе составляет 10³-10⁵, а линейные размеры чипа примерно 1 см.

В поверхностных матричных биочипах молекулярные зонды иммобилизуются на поверхности мембран или пластинок из стекла, пластика, полупроводника или металла. В гелевых биочипах зонды иммобилизуются или в слое полиакриламидного геля толщиной примерно 20 микрон, нанесенного на специально обработанную поверхность стекла, или в полусферических гидрогелевых ячейках с диаметром примерно 100 микрон. Иммобилизация осуществляется за счет образования ковалентных связей при облучении ультрафиолетовым облучением или с использованием химических реагентов. Иммобилизуемые зонды наносятся на поверхность или с помощью игольчатых растров механического робота, или с помощью технологии типа струйного принтера. Контроль качества нанесения осуществляется с помощью специализированной оптики и компьютерного анализа изображения.

Анализируемые молекулы в растворе метят с помощью флуоресцентной или радиоактивной метки. В случае смели молекул (например, ДНК дикого типа и ДНК с мутациями) каждая из компонент метится своим флуоресцентным красителем. Свойства флуоресцентного красителя не должны сильно зависеть от состава анализируемых молекул (для ДНК это A/T или G/C) и температуры раствора.

Как в поверхностных, так и в гелевых чипах гибридизация происходит в результате диффузии анализируемых молекул из раствора в ячейку и последующего образования комплексов. Интенсивности флуоресценции из ячеек измеряются с помощью сканера или люминесцентного микроскопа.

В основе принципа работы всех молекулярных биочипов с иммобилизованными зондами лежит способность биологических макромолекул к молекулярному узнаванию, то есть высокоспецифическому избирательному связыванию с другими молекулами. Так, образование дуплексов ДНК подчиняется правилу Уотсона-Крика, а рецепторы антител способны различать определенные структуры на поверхности белка. Если соответствие между иммобилизованными молекулярными зондами и меченными анализируемыми молекулами в растворе точно удовлетворяет условиям молекулярной комплементарности, то образующиеся комплексы будут термодинамически наиболее устойчивы. В результате при определенных температурах их будет больше, чем комплексов, образованных с нарушением условий комплементарности, и, соответственно, совершенным комплексам будет отвечать более сильный сигнал флуоресценции (СЛАЙД 41). В научной литературе совершенные и несовершенные комплексы, отвечающие специфичному и неспецифичному связыванию, обычно называют «перфектами» и «мисматчами». В идеале образование перфектов и мисматчей в ячейке с данными зондами должно в точности отвечать бинарным значениям 1 и 0 для ячеек электронных чипов. В реальных условиях влияние неспецифичного связывания может оказаться не столь малым, и подбор зондов, обладающих наилучшей специфичностью, является достаточно трудоемкой задачей. Так, в олигонуклеотидных чипах на дискриминацию между перфектами и мисматчами могут существенно влиять эффекты вторичной структуры (образование шпилек) для гибридизуемой ДНК, а также A/T и G/C состав иммобилизованных олигонуклеотидов, поскольку прибавлению одной A/T пары отвечает увеличение температуры плавления дуплекса примерно на 2° С, в то время как прибавлению одной G/C пары отвечает увеличение температуры плавления примерно на 4° С.

Величина сигнала и способность ячеек к дискриминации между специфичным и неспецифичным связыванием существенно зависит от плотности зондов в ячейке. При малых и промежуточных значениях плотностей зондов величина сигнала приблизительно пропорциональна плотности. Однако при большой плотности зондов возникают стерические препятствия связыванию, в результате чего сигналы выходят на насыщение, а дискриминирующая способность начинает ухудшаться.

Длинны зондов олигонуклеотидных биочипов находятся в пределах 20-60 нуклеотидов, а длины фрагментов гибридизуемой ДНК составляют 100-600 нуклеотидов.

Наилучшая дискриминация между перфектами и мисматчами достигается в условиях полного термодинамического равновесия и выхода всех сигналов флуоресценции на насыщение. Также величина сигнала флуоресценции зависит от характера подложки для ячеек с иммобилизованными зондами.

Гибридизуемая ДНК обычно заранее нарабатывается в достаточных количествах с помощью ПЦР. В более продвинутых технологиях однако ПЦР осуществляется непосредственно на чипе.

Наиболее популярным методом создании биочипов является метод APEX (Arrayed Primer Extension). Суть метода заключается в следующем (СЛАЙД 42): присоединенные к поверхности микрочипа олигонуклеотидные зонды гибридизуются с ДНК и ферментативно удлиняются на один, комплементарный точке мутации, нуклеотид с помощью меченых разными флуорофорами дидезокситерминаторов. После реакции и отмывки слайда проводится сканирование и определение интенсивности сигнала для каждого флуорофора.