Существуют два подхода к культуральному исследованию мокроты.
Первый вариант. Мокроту выливают в чашку Петри. С помощью игл, пинцета выбирают 2-3 гнойных комочка, вносят в сосуд (пробирку, колбочку) с 5-10 мл мясопептонного бульона или 2% пептонной воды (рН 7,4-7,6). Осторожно комочки 2-3 раза отмывают. Затем их переносят на питательные среды и равномерно распределяют микробиологической петлей на 1/4 поверхности чашки Петри, чашку поворачивают на 900 и стерильной петлей производят посев штрихом через участок вторичной инокуляции на третий квадрант. Чашку вновь поворачивают на 900 и стерильной петлей рассевают материал с третьего квадранта на четвертый, причем последними несколькими штрихами, не возвращаясь к третьему квадранту. Для получения отдельных колоний используют 3-4 серии штрихов.
Схема посева материала полуколичественным методом.
I II III IV
В результате «отмывки» мокроты удаётся освободиться от некоторого количества микроорганизмов – представителей нормальной микрофлоры верхних дыхательных путей. В среднем стократно снижается концентрация непатогенных нейссерий, зеленящих стрептококков, негемолитических стрептококков, стафилококков и др. При этом возможно снижение на 1-2 lg концентрации этиологически значимых микроорганизмов (пневмококков и гемофилов).
Промывные воды бронхов засевают аналогичным образом, но без предварительной отмывки.
Оценка результатов.
При появлении роста на плотных средах проводят учет колоний различной морфологии, учитывая их рост на секторах: рост колоний микроорганизмов только на I секторе - скудный рост; на I-II секторах - умеренный рост; на III- IV секторах – массивное количество.
Проводят видовую идентификацию микроорганизмов. Отрицательный результат исследования выдается при отсутствии роста на всех питательных средах в течение 3-5 суток (при исследовании на анаэробы на 8 сутки).
Второй вариант. В основе количественного метода лежит высев на плотные питательные среды из разведений гомогенизированной мокроты. Гомогенизация мокроты производится с использованием муколитиков (ацетилцистеина, мукосольвана и др.), применением ферментов (трипсина, хемотрипсина, панкреатина), физическими (ультразвук) и механическими методами (ступка с песком, размельчитель тканей и др.). Наиболее эффективно применение 0,5% раствора ацетилцистеина. В неметаллический сосуд вносят равные объёмы патологического материала (0,5-1мл мокроты) и муколитика и тщательно перемешивают пипеткой с резиновой грушей 1-2 мин. Полученный материал содержит 0,5% нативной мокроты. Затем в 1 мл обработанного материала добавляют 4,5 мл питательного бульона или 2% пептонной воды, чем достигается разведение исходного субстрата 1:10 (101).Из него готовят ряд серийных разведений до 10-7 в питательном бульоне или 2% пептонной воде. Засевают по 0,1 мл из разведений 10-7, 10-5 , 10-3 , на чашки с кровяным агаром и шоколадным агаром. Посев на ЖСА, среду Эндо (среду МакКонки), среду Сабуро, анаэробный агар делают из исходного разведения 1:10.
Содержимое бронхов, полученное при бронхоскопии или при заборе через трахеостому, засевают как мокроту, но без предварительного отмывания гнойных комочков. При отсутствии комочков гноя и слизи производят посев материала, набирая его стерильной пипеткой.
Подсчитывают каждый вид микроорганизмов. Количество микроорганизмов определяют в максимальном разведении, в котором удалось обнаружить данный вид бактерий. Например: на кровяном агаре выросли 3 колонии пневмококка при посеве 0,1 мл мокроты с разведения 10-5 , следовательно, в 1 мл мокроты содержится 3х10 и умноженное на 105 (степень разведения) = 3000000 пневмококков или 3х106.
Оценка результатов.
Диагностически значимым при исследовании мокроты является обнаружение пневмококка и гемофильной палочки (до антибактериальной терапии) в 1 мл в концентрации 106 и выше. Аналогичные концентрации значимы и для условно – патогенных микроорганизмов в случае 2-3 кратного обнаружения с интервалом 3-5 дней. Следует учитывать, что на фоне адекватной антибиотикотерапии происходит снижение количества бактерий в материале.
При количественном подсчете бактерий в трахеобронхиальных смывах, представляющих собой гомогенную взвесь, условно принимают за разведение 1:9. Диагностически значимым является обнаружение пневмококков и гемофильной палочки (до антибактериальной терапии) в концентрации 104. Аналогичные концентрации значимы и для условно - патогенных микроорганизмов в случае 2-3 кратного обнаружения с интервалом 3-5 дней.
Домашнее задание: Уч. С.А. Павлович «Микробиология с микробиологичес-кими исследованиями» с.443. Электронный вариант методической разработки лабораторно-практического занятия