13. Образование продукта при культивировании микроорганизмов. Понятие о первичных и вторичных метаболитах. Условия, определяющие образование вторичных метаболитов в клетке.

Ответ.

Метаболиты клетки, представляющие интерес как целевые продукты, разделяют на первичные и вторичные.

Первичные метаболиты это низкомолекулярные соединения, необходимые для роста микроорганизмов. Они образуются в результате биохимических реакций, идущих в клетке, и являются строительными блоками для построения структурных элементов клетки (макромолекул, ферментов). Это аминокислоты, нуклеотиды, витамины, промежуточные вещества ассимиляции углеводов, азота и др. субстратов.

Вторичные метаболиты это низкомолекулярные вещества, не требующиеся для роста клетки (образования её структур). Они синтезируются в клетках некоторых групп микроорганизмов и часто представляют собой смесь близкородственных соединений, относящихся к одной химической группе. Как правило, они образуются на последних стадиях развития культуры. К вторичным метаболитам относятся антибиотики, алкалоиды, гормоны роста растений, токсины, пигменты.

В норме метаболизм микробной клетки настроен так, чтобы производить минимальное количество метаболитов, необходимых для поддержания её жизни и размножения. Практически весь источник углерода в процессе обмена превращается в биомассу и конечные продукты энергетического метаболизма. Но некоторые виды микроорганизмов обладают способностью к синтезу в незначительных количествах несущественных для них вторичных метаболитов.

Вторичные метаболиты, образуемые на последних стадиях развития культур – это не резервные вещества, а метаболиты, образующиеся из промежуточных продуктов обмена, когда путь синтеза нормальных продуктов обмена, связанных с ростом заблокирован. Это связано с истощением среды. В результате новые условия индуцируют синтез новых ферментов, катализирующих синтез вторичных метаболитов.

Вторичный метаболизм важен не как синтез защитных веществ, а как способ продления жизнедеятельности культур, когда в среде не хватает субстратов для синтеза биомассы.

Это подтверждает тот факт, что некоторые вторичные метаболиты имеют сходство с нормальными составными частями клетки. Например, молекула антибиотика стрептомицина имеет химическое сходство с компонентами клеточной стенки, что является результатом неудавшегося синтеза нормальных частей клетки в условиях лимитации роста

Способность к сверхсинтезу как первичных, так и вторичных метаболитов приобретают штаммы микроорганизмов, у которых в результате мутаций нарушаются процессы регуляции синтеза некоторых продуктов обмена.

14. Образование продукта при культивировании микроорганизмов. Двухфазность в развитии популяций. Условия, определяющие переход культуры из первой фазы развития во вторую?

Ответ.

В процессе культивирования микроорганизмов накопление в среде продуктов обмена во многих случаях происходит с некоторой задержкой по сравнению с ростом клеток. Следовательно, период развития популяции можно разделить на две фазы: первая фаза (тропофаза) – нарастание биомассы, вторая (идиофаза) – накопление в среде продуктов обмена.

Впервые это явление было открыто на бактериальных брожениях Шапошниковым (1960 г) – ацетоно–бутиловое брожение.

Шапошников считал, что двухфазность отражает перераспределение окислительно–восстановительных реакций, происходящих при использовании углеводов.

В первую фазу, идет быстрый рост клеток. Синтезируемая биомасса, в значительной степени состоит из белка. Она богаче водородом, чем углеводы, и в среде накапливаются более окисленные продукты обмена веществ – кислоты.

Вторая фаза начинается с замедления роста культуры. Когда рост практически закончен, оставшиеся углеводы перерабатываются в более восстановленные продукты – спирты или другие метаболиты, например антибиотики. Продукты микробного метаболизма, образуемые на последних стадиях развития культур, называют «вторичными метаболитами», а явление – синтезом «вторичных метаболитов».

Теоретические исследования закономерностей образования вторичных метаболитов показали, что их интенсивный синтез происходит только при уменьшении скорости роста культуры по сравнению с максимально возможной.

Факторами, лимитирующими рост продуцентов, могут служить компоненты питательной среды (углеводы, азот, фосфор).

Концентрации питательных субстратов, оптимальные для процессов роста продуцента и образования вторичных метаболитов имеют различные значения.

Для интенсивного роста микроорганизма достаточно обеспечить избыток питательных субстратов в среде.

Интенсивный биосинтез продукта вторичного метаболизма возможен только в определенном узком диапазоне концентраций субстратов, способных лимитировать рост.

Управлять процессом перехода культуры из первой фазы во вторую можно путем изменения (регуляции) значений концентраций лимитирующих субстратов, с последующим поддержанием их на уровнях, оптимальных для процессов роста микроорганизмов или интенсивного синтеза целевого продукта (вторичного метаболита).

Условия культивирования, такие как температура, рН, аэрация и перемешивание также влияют на процессы метаболизма. Их значения, оптимальные для периодов роста (1 фаза) и биосинтеза (2 фаза) различны. Например, рост продуцента рибофлавина одинаково интенсивен и при 28 и при 37⁰С, биосинтез рибофлавина наблюдается при 28⁰С

Т.о. основным условием, определяющим переход культуры из 1 фазы развития во вторую, является снижение скорости роста продуцента. Управлять этим процессом можно путем изменения концентраций питательных субстратов в среде и условий культивирования.

15. Основные понятия о периодическом методе культивирования. Параметры контроля и управления при проведении периодической ферментации. Производительность и продуктивность процесса периодической ферментации.

Ответ.

При периодическом методе культивирования микроорганизмов – в биореактор загружаются питательная среда и посевной материал, после чего в аппарате, в течение определенного времени, проводится процесс, по завершении которого полученная культуральная (ферментационная) жидкость выгружается из аппарата и передаётся на стадии выделения и очистки целевого продукта. Затем процесс повторяют.

В периодическом процессе состав среды по ходу процесса постоянно изменяется, а физиологическое состояние популяции является функцией непрерывно изменяющихся условий среды. Развитие популяции идет постадийно и заканчивается через определенное время при исчерпании питательных субстратов

Сложность биологических систем вызывает необходимость контроля за процессом в биореакторе. Число контролируемых параметров зависит от специфики процесса биосинтеза.

Контроль осуществляется физическими, химическими, механическими, биохимическими и биологическими методами

Основные контролируемые параметры, характеризующие течение процесса в биореакторе: концентрация биомассы, концентрация питательных веществ (углеводов, азота, фосфора), водородный показатель среды (рН), температура, количество растворенных кислорода и диоксида углерода, концентрация целевого продукта, физиологичекое состояние микроорганизма – продуцента, вязкость среды.

Для регулирования и стабилизации технологических параметров разработаны системы автоматического контроля и управления ферментационными процессами.

Управление процессом биосинтеза осуществляется путем: регулирования температуры, интенсивности дыхания продуцента, добавления питательных субстратов (предшественников, источников углеводов, азота, фосфора и др.) по ходу процесса, корректировки рН (добавлением растворов титрантов).

Продуктивность и производительность процесса в биореакторе оценивается по следующим показателям.

1) Общая продуктивность процесса Q_p определяется количеством целевого продукта, полученного с 1 м³ ферментационной ёмкости в час

Q_p = , кг/м³ час

где V_к.ж. – объём культуральной жидкости, полученный за 1 цикл ферментации, м³

Р – концентрация продукта

V_ф – вместимость ферментатора, м³

– продолжительность 1 цикла ферментации, равная сумме продолжительностей

ферментации и подготовки аппарата

2) Объёмная продуктивность процесса Q_ср – это количество целевого продукта, получаемое с 1 м³ среды в час

Q_ср = , кг/м³ час где V_п.ср – объём питательной среды, м³

3) Выход продукта от субстрата Y_ps – количество целевого продукта, полученного с 1 кг питательной среды, являющегося источником энергии для процесса биосинтеза.

Y_ps = , кг/кг где m_s – исходное содержание источника энергии в субстрате, кг

16. Основные понятия о непрерывном методе культивирования. Разновидности непрерывных процессов. Хемостатный способ непрерывного культивирования. Материальный баланс для процесса в хемостате. Понятие о скорости разбавления.

Непрерывный метод культивирования микроорганизмов – это процесс, при проведении которого, в биореактор непрерывно вводится свежая питательная среда и одновременно удаляется из системы эквивалентное количество культуральной жидкости с содержащимися в ней микробными клетками и продуктами метаболизма. Скорость роста микроорганизма в непрерывном процессе регулируется концентрацией в среде лимитирующих, ингибирующих или стимулирующих рост факторов.

Существует две разновидности непрерывных процессов: процессы полного вытеснения (тубулярные) и процессы полного перемешивания (хемостатные).

Хемостатный процесс протекает при непрерывном перемешивании – в аппарате с мешалкой (см. рисунок).

Засев питательной среды производится единовременно при запуске процесса. После накопления определенного количества биомассы в системе, начинается непрерывная (с постоянной скоростью) подача питательной среды в биореактор, а из него, также непрерывно, с той же скоростью, отводится часть культуральной жидкости. Таким образом объём жидкости в аппарате поддерживается на постоянном уровне.

При правильном ведении процесса микроорганизм получает постоянное количество питательных веществ, которое соответствует потребностям роста, размножения и биосинтеза целевого продукта на данном этапе развития культуры.

Предполагают, что в любой точке аппарата и на выходе из него концентрации S, Х и Р равны.

Культура микроорганизма как бы фиксируется, в одной, например, экспоненциальной фазе роста, что позволяет продлить жизнь микробной популяции и получать нужные продукты обмена или биомассу по времени столь долго, сколько требуется.

Материальный баланс по биомассе для хемостата выражается следующим уравнением:

Накопление клеток = масса клеток + прирост клеток – масса клеток, унесенных – погибшие

внесенных в систему из системы клетки

где Х и Х₀ –масса клеток в субстрате, вводимом в биореактор, г/л; F –скорость потока среды, л/ч; V – объём жидкости в биореакторе; – удельные скорости роста и гибели клеток, ч^–1;

t – время, ч

В установившемся режиме накопления клеток нет ( = 0), а скорость роста значительно превышает скорость гибели клеток (допускают = 0), Х₀ = 0, т.к. в биореактор вводится стерильная среда. Значит уравнение принимает вид , отсюда

Величина D называется скоростью разбавления. Она характеризует скорость потока среды, отнесенную к объёму культуральной жидкости в хемостате. В стационарном режиме удельная скорость роста равна скорости разбавления. Это управляемый параметр, задаваемый оператором.

17. Основные понятия о непрерывном методе культивирования. Разновидности непрерывных процессов. Тубулярный процесс непрерывного культивирования: сущность, схема процесса, сходство тубулярного процесса с периодическим, математическое описание процесса, примеры применения, преимущества и недостатки.

Ответ

Непрерывный метод культивирования микроорганизмов – это процесс, при проведении которого, в биореактор непрерывно вводится свежая питательная среда и одновременно удаляется из системы эквивалентное количество культуральной жидкости с содержащимися в ней микробными клетками и продуктами метаболизма. В итоге концентрация биомассы и другие параметры в ходе процесса поддерживаются на постоянном заданном уровне в течение длительного времени.

Существует две разновидности непрерывных процессов: процессы полного вытеснения (тубулярные) и процессы полного перемешивания (хемостатные).

В тубулярном процессе питательная среда и посевной материал смешиваются на входе в аппарат, который выполнен в виде длинной трубы большого диаметра (см рис), после чего поступают в биореактор непрерывным потоком. По мере их продвижения (по типу поршня) в аппарате одновременно осуществляются рост биомассы и процесс ферментации (биосинтез целевого продукта).

Движение может быть горизонтальным или вертикальным. Например, в аппарате башенного типа жидкость движется снизу вверх.

Рис. – Схема тубулярного непрерывного процесса

Время движения жидкости t₁ от входа в аппарат до любого сечения по длине потока l можно рассчитать как ,

где А — площадь сечения потока; F— объемный расход жидкости.

На выходе из аппарата (при 1= L) время пребывания жидкости составляет: t_L = L A/F.

Кривые изменения концентраций субстрата S, биомассы X и продукта Р в зависимости от длины аппарата (l), аналогичны кривым изменения таких же параметров в зависимости от времени в периодическом процессе.

Таким образом, закономерности протекания тубулярнного процесса непрерывной ферментации полностью подобны закономерностям протекания периодического процесса ферментации.

Необходимость непрерывной подачи посевного материала усложняет процесс и делает его технологически неудобным.

Для исключения необходимости постоянного введения посевного материала в систему, организуют рециркуляцию части потока с выхода аппарата на вход (т.е. часть к.ж., выходящей из аппарата возвращается в биореактор).

Преимуществом тубулярного процесса является возможность более полного исчерпания субстрата (как и в периодическом процессе).

Недостатком — невозможность организовать аэрацию во всех зонах по длине аппарата, большая склонность к инфицированию.

Тубулярный способ часто выбирают для анаэробных процессов. Например, в башенном способе производства пива, при анаэробной очистке сточных вод.

18. Основные понятия о непрерывном методе культивирования. Разновидности непрерывных процессов. Хемостатный и турбидостатный способы непрерывного культивирования? Чем они различаются? Какие уравнения определяют установившийся режим в хемостате?

Непрерывный метод культивирования микроорганизмов – это процесс, при проведении которого, в биореактор непрерывно вводится свежая питательная среда и одновременно удаляется из системы эквивалентное количество культуральной жидкости с содержащимися в ней микробными клетками и продуктами метаболизма. Скорость роста микроорганизма в непрерывном процессе регулируется концентрацией в среде лимитирующих, ингибирующих или стимулирующих рост факторов.

Существует две разновидности непрерывных процессов: процессы полного вытеснения (тубулярные) и процессы полного перемешивания (хемостатные).

Хемостатный процесс протекает при непрерывном перемешивании – в аппарате с мешалкой (см. рисунок).

Засев питательной среды производится единовременно при запуске процесса. После накопления определенного количества биомассы в системе начинается непрерывная, с постоянной скоростью, подача питательной среды в биореактор, а из него, также непрерывно, с той же скоростью, отводится часть культуральной жидкости. Объём жидкости в аппарате поддерживается при этом на постоянном уровне.

При правильном ведении процесса микроорганизм получает постоянное количество питательных веществ, которое соответствует потребностям роста, размножения и биосинтеза целевого продукта. Культура микроорганизма как бы фиксируется, в одной, например, экспоненциальной фазе роста, что позволяет продлить жизнь микробной популяции и получать нужные продукты обмена или биомассу по времени столь долго, сколько требуется

Предполагают, что в любой точке аппарата и на выходе из него концентрации S, Х и Р равны.

Хемостат функционирует при избытке всех питательных субстратов за исключением одного – лимитирующего рост. Другие факторы окружающей среды (рН, t, растворенные О₂ и СО₂) должны поддерживаться на заданном уровне.

Установившийся режим в хемостате определяют два уравнения:

1) = D удельная скорость роста равна скорости разбавления D

2) X = Y_XS (S₀ – S)

где Х – концентрация биомассы, г/л: Y_XS – коэффициент превращения субстрата в целевой продукт (напр. Y_XS для глюкозы равен 0,5 – значит, получение 30 г биомассы обеспечит 60 г глюкозы);

S₀ и S – концентрации лимитирующего субстрата на входе в биореактор и выходе из него

Как альтернатива хемостату разработаны другие варианты непрерывного процесса ферментации, обеспечивающие поддержание культуры в состоянии динамического равновесия (когда μ = D), одним из которых является турбидостатный.

При турбидостатном культивировании поддерживается на постоянном уровне концентрация биомассы путем изменения скорости разбавления. Одним из способов измерения концентрации биомассы является турбидиметрический (определение оптической плотности культуры или степени поглощения светового потока клеточной суспензией).