Тема шестая превращение веществ в растениях
В целом обмен веществ - совокупность огромного числа физических и биохимических реакций, объединенных в пространстве и во времени в единое и упорядоченное целое, подчиняющееся законам термодинамики и обеспечивающее жизнедеятельность растения.
Работа 17. Получение амилазы из солода и обнаружение ее действия
ХОД РАБОТЫ
Половину чайной ложки солода растирают в ступке, приливают около 20 мл теплой воды, смесь взбалтывают и оставляют на 10 минут. Затем отфильтровывают через бумажный фильтр в коническую колбу. Первые порции мутного фильтрата сливают обратно на фильтр. В фильтрат перейдет фермент амилаза, расщепляющий крахмал.
Наиболее чувствительной цветной реакцией на крахмал и продукты его гидролиза является йодная проба. Для обнаружения действия амилазы берут слабый раствор йода, который готовят следующим образом; небольшое количество концентрированного раствора йода в йодистом калии приливают в колбочку и разбавляют дистиллированной водой до появления светло-желтой окраски. Приготовленный раствор разливают в два ряда пробирок (всего 20-24) по 5 мл. Берут 2 конические колбочки, наливают в них по 30 мл раствора крахмала, добавляют по 5 мл отфильтрованной солодовой вытяжки с амилазой. Одну колбочку оставляют на столе при комнатной температуре, а другую помещают в водяную баню, нагретую до 55°С Во избежание разрушения фермента не следует допускать перегрева бани В первую пробирку каждого ряда приливают 1 мл через каждые 2 минуты и вносят в очередную пробирку с раствором йода соответствующего ряда. Йод будет окрашивать крахмал и продукты его гидролиза в разные цвета: в типично синий, характерный для неизмененного крахмала, затем в сине-фиолетовый и темно-фиолетовый (амилодекстрины), красно-бурый (эритродекстрины) и желтый (ахродекстрины). Получается как бы цветная шкала постепенного гидролиза крахмала.
Когда внесенная проба (1 мл) уже не будет изменять светло-желтой окраской йода, это указывает на окончание гидролиза крахмала, из колбочки берут 2 мл раствора, переносят в пробирку и добавляют такое же количество фелинговой жидкости. Образование кирпичного красного осадка закиси меди после кипячения содержимого пробирки свидетельствует о присутствии низкомолекулярных восстанавливающих (редуцирующих) Сахаров в испытуемом растворе появившихся в результате гидролиза крахмала.
Аналогичную реакцию проводят с исходным крахмалом Время окончания его гидролиза в первой и во второй колбочках дает возможность судить о скорости процессов при разных температурах. Результаты опыта учитывают по схеме:
Условия опыта |
Окраска рас-ра йода в пробирках |
Начало опыта |
Окончание опыта |
Время гидролиза |
|||||||||
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
||||
Комнатная температура |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Температура 55C |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
1) солод; 2) 2%-ный раствор крахмала; 3) раствор йода в йодистом дат; 4} пипетки на 1 мл, 20 мл; 5) термометр; 6) штатив с пробирками; ?) юронки; 8) фильтры; 9) жидкость Фелинга; 10) водяная баня.
Работа 18. Выделение В-фруктофуранозидазы из дрожжей и ферментативный гидролиз сахарозы
Данный фермент (прежнее название инвертаэа или сахараэа) разлагает сахарозу на фруктозу и глюкозу (инвертный сахар);
C12H22O11 + H2O = С6Н12О6 + С6Н12О6 сахароза глюкоза фруктоза
ХОД РАБОТЫ
2-3 г прессованных дрожжей смешивают с 2-3 г кварцевого песка, доливают 5 мл воды и тщательно растирают в фарфоровой ступке. Затем приливают еще 15 мл воды, нагретой до 40°С, и продолжают растирание в течение 10 минут. Раствор профильтровывают через складчатый фильтр. Первые порции мутного фильтрата сливают снова на фильтр. На фильтре будет находиться В-фруктофуранозидаза, расщепляющая сахарозу на глюкозу и фруктозу.
В три пробирки помещают по 5 мл 2%-ного раствора сахарозы. Одну оставляют для контроля, во вторую приливают 1 мл фильтрата, в третью также 1 мл фильтрата, но предварительно прокипяченного.
Пробирки ставят в водяную баню с температурой 40°С. Через 15-20 минут в них добавляют 5 мл реактива Фелинга, а затем содержимое следует хорошо прокипятить на горелке. В присутствии восстанавливающих сахароз выпадает кирпично-красный осадок закиси меди (Cu20).
На основании результатов реакции делают заключение о действии фермента В-фруктофуранозидазы и о влиянии на его активность высокой температуры.
Результаты записывают по схеме:
Вариант |
Состав смеси в пробирке, мл |
Результат |
||
Сахароза, 2%-ный р-р |
Фильтрат- носитель фермента |
|||
Без кипячений |
После кипячения |
|||
1 |
5 |
- |
- |
|
2 |
5 |
1 |
- |
|
3 |
5 |
- |
1 |
|
МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
1) дрожжи прессованные; 2) ступка; 3) кварцевый песок; 4) воронки; 5) штатив с пробирками; 6) водяная баня; 7) 2%-ный раствор сахарозы 8) реактив Фелинга; 9) пипетки, 10) фильтровальная бумага.
Работа 19. Определение активности липаз в процессе прорастания семян
При прорастании семян масличных растений, отличающихся высоким содержанием триглицеридов, отмечается быстрое уменьшение содержания жиров и одновременно увеличивается концентрация сахарозы. Образование углеводов из жиров - многоэтапный процесс, четко разграниченный в пространстве и во времени. С момента начала набухания семян масличных культур первым ферментом, атакующим молекулу жира (триглицерида), является нейтральная липаза
Установлено, например, что в семенах клещевины эта липаза активируется одной из протеиназ, присутствующих в эндосперме.
Липаза ступенчато гидролизует триглицерид до диглицерида, моноглицерида и, наконец, до свободного глицерина и жирных кислот.
Липазы, присутствующие в семенах масличных растений, проявляют активность при различных значения рН. Поэтому иногда употребляют названия нейтральной, кислой и щелочной липазы. Наиболее активными в семенах масличных является кислая и щелочная липазы. Определение их активности основано на учете концентрации жирных кислот, образующихся при действии на чистый препарат какого-либо жира (масла)экстрактом липаз, выделенным из семян разных периодов проращивания.
ХОД РАБОТЫ
Для навески очищенных от кожуры прорастающих семян подсолнечника (по 3 г каждая) помещают в фарфоровые ступки, приливают по 1 мл чистого подсолнечного масла и тщательно растирают в течение 3-4 минут. Затем в одну из ступок приливают 6 мл ацетатного буфера с рН=4,7, а в другую - 5 мл боратного буфера с рН=8.5 и продолжают растирание в течение 2 минут. Затем содержимое ступок количественно переносят в две конические колбы емкостью 100 мл. Ступку и пестик ополаскивают 5 мл воды, сливая промывные воды в соответствующую колбу, добавляют по 5 капель толуола, плотно закрывают пробками и ставят на ротатор, где перемешивают в течение 30 минут. После этого колбы ставят на 20 часов в термостат, нагретый до 30 °С
Одновременно готовят две контрольные пробы (для каждого рН), с которым проделывают те же операции, что и при исследовании образцов, однако перед помещением контрольных колб в термостат их содержимое кипятят 5-10 минут на электроплитке для инактивации липаз.
Через 20 часов (на следующий день) колбы вынимают из термостата, приливают в каждую из них по 50 мл смеси этилового спирта с эфиром в соотношении 4:1, встряхивают и дают несколько минут отстояться. Далее добавляют по 4-5 капель тимолфталеина и содержимое колб титруют 0,1 н спиртовым раствором NaOH. Активность кислых и щелочных липаз выражают в миллилитрах 0,1 н NaOH, пошедшей на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся в результате действия липаз на 1 г семян.
Результаты рассчитывают по формуле:
где АЛ - активность липазы (кислой или щелочной);
а и в - количество 0,1 н NaOH, затраченное на титрование опытного и контрольного образцов, мл;
Т - поправка к титру 0,1 н раствора NaOH;
Н - навеска семян, г.
Заполняют таблицу:
№ п/п |
Объект исследования,рН |
Навека материала, (Н),г |
Пошло на титрование 0,1 н р-ра NaOH, мл |
Активность липазы (АЛ), мл 0,1 н NaOH/г |
|
Исследуемого р-ра(а) |
Контрольного р-ра (в) |
||||
1 |
|
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
4 |
|
|
|
|
|
МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
1.семена подсолнечника, отобранные а различные периоды проростания. 2) ацетатный буфер с рН=4,7; 3) боратный буфер рН=8,5; 4)подсолнечное масло; 5) 0,1 н спиртовой раствор NaOH; 6) смесь этилового спирта с эфиром (4:1); 7) толуол; 8) 1%-ный спиртовой р-р тимолфталеина; 9) фарфоровые ступки с пестиком; 10)конические колбы на 100 мл; 11) мерные цилиндры на 10 и 50 мл.; 13) аналитические весы; 14) термостат; 15) электроплитка.
Работа 20. Превращение запасных веществ при прорастании семян.
ХОД РАБОТЫ
Растереть в четырех ступках непроросшие и проросшие семена- крахмалистые(пшеница) и маслянистые (клещевина). Маслянистые семена перед измельчением желательно очистить от кожуры. Поместить материал в разные пробирки, залить небольшим количеством воды, нагреть в кипящей водяной бане. Слить вытяжки в чистые пробирки, прилить равный объем реактива Фелинга и довести до кипения.
Па количеству образовавшейся закиси меди дать оценку содержания редуцирующих Сахаров. К оставшемуся в пробирках материалу (мезге) прилить раствор йода и по интенсивности посинения дать оценку содержания крахмала.
Сделать тонкие срезы непроросших и проросших маслянистых семян, поместить на предметные стекла в капли раствора Судан 2, закрыв покровными стеклами.
Через 5 минут промыть срезы водой, рассмотреть в микроскоп и дать оценку содержания жира - по количеству и размерам капель, окрашенных в красный или оранжевый цвет
Нанести в капли на предметные стекла небольшое количество эндосперма непроросших и проросших семян пшеницы (не подвергавшихся нагреванию), рассмотреть в микроскоп и зарисовать крахмальные зерна. Результаты записать в таблицу, оценивая содержание соответствующих веществ в баллах.
Семена |
Крахмал |
Жир |
Редуцирующие сахара |
Крахмалистые непроросшие |
|
|
|
Крахмалистые проросшие |
|
|
|
Маслянистые непроросшие |
|
|
|
Маслянистые проросшие |
|
|
|
Сделать выводы о превращении веществ при прорастании крахмалистых и маслянистых семян.
МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
1) семена различных растений (сухие и проросшие); 2) фильтровальная бумага; 3) краситель Судан III; 4) реактив Фелинга; 5) водяная баня; 6) йод в йодистом калии.