2.3 Визначення вмісту білку

Методи кількісного визначення білків, які використовують в практиці, засновані на аналізі складових частин макромолекул або дослідженні деяких фізичних властивостей розчинів білків, що змінюються в прямій залежності від їх концентрації. У першому випадку про зміст білка в досліджуваному об'єкті судять за кількістю азоту або деяких специфічних угрупувань атомів, загальних для різних білків, а також залишків тієї чи іншої амінокислоти.

2.3.1 Визначення вмісту загального і небілкового азоту методом К'єльдаля.

Метод визначення азоту заснований на мінералізації органічних сполук з подальшим визначенням азоту за кількістю утвореного аміаку.

Мінералізація здійснюється нагріванням наважки з концентрованою сірчаною кислотою в присутності каталізатора (ртутно-кадмієва сіль або сульфатна суміш, або перекис водню). Аміак, який виділився, вступає в реакцію з надлишком концентрованої сірчаної кислоти і з утворенням сульфату амонію.

2NH₃ + H₂SO₄ → (NH₄)₂SO₄

Для виділення аміаку сульфат амонію розкладають концентрованим гідроксидом натрію.

(NH₄)₂SO₄ + 2NaOH → 2NH₃ + 2H₂O + Na₂SO₄

Аміак, який виділився, поглинається титрованими розчинами сірчаної кислоти.

2NH₃ + H₂SO₄ → (NH₄)₂SO₄

Надлишок сірчаної кислоти відтитровують гідроксидом натрію і за кількістю пов'язаної кислоти обчислюють кількість поглиненого аміаку або відповідну йому кількість азоту.

Реактиви. Використовують сірчану кислоту (густина 1840 кг/м³); 0,05 M і 0,0075 M розчини сірчаної кислоти; кристалічний сульфат калію; кристалічний сульфат міді; селен металевий; оксид ртуті (жовтий); 30%-ний розчин пероксиду водню, 50%-ний, 40%-ний, 0,1 M і 0,015 M розчини гідроксиду натрію; індикатор Таширо (суміш 0,4 г метилового червоного і 0,2 г метиленової сині, розчиненої в 200 мл 96°-ного етанолу); лакмусовий папір; 20%-ний розчин трихлороцтової кислоти; 8%-ний розчин тіосульфату натрію.

Порядок виконання роботи.

Визначення загального азоту.

Беруть наважку досліджуваного об'єкта (0,5-1,0 г) з точністю до 0,0002 г (зважування в бюксі з паличкою), переносять на беззольний фільтр площею 20 см² і разом з ним поміщають в колбу К'єльдаля місткістю 100-150 мл. Для контрольного досліду такий же листок беззольного фільтру поміщають в іншу колбу К'єльдаля. В обидві колби додають 10-15 мл концентрованої сірчаної кислоти (густиною 1840 кг/м³) і проводять мінералізацію, застосовуючи різні каталізатори (ртутної каталізаторної суміші (селен металевий, жовтий оксид ртуті і сульфат калію, взяті у співвідношенні 0,3:3:100), сульфату калію і пероксиду водню, сульфату міді і сульфату калію ).

При використанні сульфатної каталізаторної суміші до вмісту колби К'єльдаля додають 2-3 г сульфату міді і сульфату калію, взятих у співвідношенні 1: 10, і нагрівають колбу до отримання прозорого розчину зеленувато-блакитного кольору. Мінералізація триває 5-6 год. при температурі 500-600ºС.

Після мінералізації колбу охолоджують і вміст кількісно переносять в мірну колбу місткістю 100-200 мл (виходячи з маси наважки), обсяг доводять дистильованою водою до мітки і перемішують.

Аміак відганяють у перегонному пристрої.

Перед тим, як приступити до відгонки аміаку, готують приймальну колбу конічної форми місткістю 250-300 мл, у яку додають 30-50 мл 0,1Н розчину сірчаної кислоти та 2-3 краплі індикатора Таширо, який змінює колір при рН 5,4 від синьо-фіолетового у кислому середовищі до зеленого – у лужному.

Приймальну колбу встановлюють у пристрій для відгонки аміаку так, щоб кінець холодильника був занурений у титрований розчинсірчаної кислоти.

Після цього у відгонну колбу додають обережно надлишкову кількість (80-90 мл) 30-40%-ного розчину лугу. Надлишок перевіряють лакмусовим папірцем. Колбу встановлюють у прилад для відгонки аміаку, закривши краплеуловлювачем, з’єднаним з холодильником. Рідину у відгонній колбі нагрівають до кипіння.

Аміак відганяють до тих пір, поки об'єм рідини в приймальній колбі не збільшиться в 2-3 рази. Повноту відгонки перевіряють по червоному лакмусовому папірці. Потім приймальну колбу опускають і залишок кислоти з кінця холодильника змивають дистильованою водою.

Надлишок кислоти в приймальній колбі відтитровують 0,1 М розчином гідроксиду натрію в присутності 1-2 крапель індикатора Таширо до зеленого забарвлення.

Кількість загального азоту розраховують за формулою:

х = 0,0014 (V – V₁) ∙ K ∙ 100 / m₀

де х - кількість загального азоту, %;

0,0014 - кількість азоту, еквівалентна 1 мл 0,1 М розчину гідроксиду натрію, г;

V - об'єм 0,1 М розчину гідроксиду натрію, що пішов на титрування обсягу кислоти в приймальні колбі, мл;

V₁ - об'єм 0,1 М розчину гідроксиду натрію, що пішов на титрування надмірної кількості кислоти, мл;

К - коефіцієнт перерахунку на точно 0,1 М розчин гідроксиду натрію;

Визначення небілкового азоту.

Небілковий азот - це сума азоту поліпептидів, амінокислот, інших азотистих органічних сполук і амонійних солей.

Небілковий азот визначають в мінералізованому фільтраті, ориманому після осадження білку трихлороцтовою кислотою.

Наважку (2 г) 4 рази екстрагують при ретельному перемішуванні 20 мл води, щоразу зливаючи екстракт через паперовий фільтр у мірну колбу місткістю 100 мл. З останнім екстрактом осад також переносять на фільтр і промивають, збираючи промивні води і мірну колбу. Вміст колби доводять водою до мітки. Із отриманого розчину відбирають 30 мл і змішують з рівним об'ємом 20%-ного розчину трихлороцтової кислоти. Випавший осад відокремлюють фільтруванням.

У фільтраті визначають залишковий азот. Для цього 25 мл фільтрату минералізують з наступною відгонкою аміаку. Вміст залишкового азоту розраховують за формулою:

х = 0,0014 ∙ 100 ∙ 60 (V – V₁) ∙ K ∙ 100 / (m₀ ∙ 30 ∙ 25)

де х - вміст залишкового азоту, %;

0,0014 - кількість азоту, еквівалентна 1 мл 0,1 M розчину гідроксиду натрію,

100 - об'єм екстракту, мл,

60-об'єм розчину при осадженні білків, мл;

V - об'єм 0,1 M розчину гідроксиду натрію, що пішов на титрування обсягу кислоти в приймальні колбі, мл;

V₁ - об'єм 0,1 M розчину гідроксиду натрію, що пішов на титрування надмірної кількості кислоти, мл;

m₀ - маса наважки, г;

30 - об'єм розчину, взятий на осадження білків, мл;

25-обсяг фільтрату. i, взятий на мінералізацію, мл.

Вміст білкових речовин в продукті визначають за кількістю білкового азоту, який знаходять за різницею між кількістю загального і небілкового азоту з урахуванням коефіцієнта перерахунку азоту на білок. Вміст азоту для багатьох білків; близько до 16%, тому кількість білкових речовин обчислюють, множачи отриману кількість азоту на коефіцієнт 6,25. Для визначення вмісту білків сполучної тканини користуються коефіцієнтом 5,62, приймаючи до уваги, що вміст азоту в колагені 17,8%, білків молока та молочних продуктів - коефіцієнтом 6,37, білків сої - 6,25.