2.2. Регуляция клеточного цикла. Апоптоз. Онкогенетика.

Митотический цикл и его регуляция. Роль циклинов и циклинзависимых киназ. Принципы передачи митогенного сигнала. Роль факторов роста, интегринов и кадгеринов. Контрольные точки митотического цикла. Апоптоз.

Генетические механизмы канцерогенеза. Общая характеристика генов, берущих участие в канцерогенезе: вирусные онкогены, протоонкогены, гены-супрессоры опухолей, гены-мутаторы. Канцерогенные факторы.

Митотический цикл и его регуляция. Казалось бы, давно известная вещь – фазы цикла (G₁, S, G₂, M), стадии митоза (профаза, метафаза, анафаза и телофаза), - все уже сто лет как описано и изучено.

Но что заставляет клетку «двигаться» по этому кругу? Как удается ей обеспечить строго упорядоченную смену множества событий, составляющих клеточный цикл? Какие механизмы запускают, например, синтез ДНК в S-фазе, а затем во время его останавливают, предупреждая повторное удвоение ДНК? Как и почему происходит разрушение ядерной оболочки в поздней профазе, а затем образование сразу двух таких оболочек в телофазе? И так далее – подобные вопросы уместны в отношении каждого процесса.

Долгое время все это было совершенно неясно. И только благодаря исследованиям последних лет перед нашим взором стала проступать, с одной стороны, чрезвычайно удивительная (по своей сложности и «продуманности»), а с другой стороны, вполне естественная картина под названием «Регуляция клеточного цикла».

На протяжении клеточного цикла разные клетки могут вступать в различные процессы.

Действительно, делящиеся клетки могут не только продолжать делиться или временно прекратить деления, впав в «спячку» (как бывает со стволовыми клетками). Их судьба, в зависимости от целого ряда обстоятельств (генетической программы, действия гистогормонов, влияние прочих внутренних и внешних факторов), может очень круто измениться. Вот наиболее драматические варианты:

- клетка вступает в процесс дифференцировки,

- в клетке запускаются механизмы самоуничтожения (апоптоза),

- клетка подвергается бласттрансформации, т. е. превращается в опухолевую клетку.

Все это процессы чрезвычайной биологической важности. И то, в какой именно из них вступит делящаяся клетка, определяется в ходе клеточного цикла.

Длительность клеточного цикла изменяется в зависимости от типа клетки и стадии развития организма. Например, клеточный цикл оплодотворенного яйца очень непродолжителен. Оплодотворенное яйцо лягушки делится очень быстро (около 30 минут). Большую часть этого времени занимают S и М фазы, а на фазы G₁ и G₂ затрачивается очень мало времени. Поскольку в яйце уже существует большой запас белков и других веществ, необходимых для клеточного деления, синтеза новых белков почти не требуется. Таким образом, G₁,₂- фазы укорачиваются.

На ранних стадиях развития необходимо сформировать как можно больше клеток за относительно короткий промежуток времени. Например, в оплодотворенном яйце лягушки в течение 6 часов происходит 12 дроблений и образуется эмбрион из 8192 клеток. Клетки делятся быстро, но увеличиваются в размерах незначительно. Тем не менее, за счет огромного количества клеток и некоторой ассиметрии деления, эмбрион формируется в течение нескольких часов. После того, как эмбрион сформирован, и закладка трех основных типов ткани завершена, время, необходимое для клеточного цикла, увеличивается за счет удлинения G-фаз. Синтез новых белков приводит к тому, что клетка увеличивается в размере и объеме.

Клеточный цикл оплодотворенного яйца человека, в отличие от яйца лягушки, длится значительно дольше. Первое деление длится 30 часов, а весь процесс дробления – 7 суток (у лягушки – 6 часов).

Однако примерная продолжительность стадий цикла для быстро делящихся клеток человека составляет:

S-период – 10 ч,

G₂-период – 4,5 ч,

М-период – 0,5 ч,

G₁-период – 9 ч.

Итого – 24 ч (рис.42.). Но, разумеется, это очень приблизительные оценки, и для каких-то клеток цикл может быть более продолжительным. В частности отмечалось, что для сперматогоний S-период длится 15 часов. И, соответственно, в 1,5 раза больше оказывается у них продолжительность цикла – примерно 1,5 суток. Так что на 10 митотических делений сперматогоний (происходящих на первом этапе сперматогенеза) требуется 2 недели.

Рис.42. Клеточный цикл: митоз и цитокинез (клеточное деление) составляют М-фазу цикла, кульминацией, которой является образование двух дочерних клеток. Каждая дочерняя клетка вступает в G₁-период интерфазы и может начать новый клеточный цикл. За периодом G₁ следует S-фаза, во время которой ДНК и хромосомы дуплицируются, и далее – фаза G₂. Начало митоза означает конец интерфазы. Покоящиеся клетки задерживаются в фазе G₁ и, как говорят, находятся в фазе G₀. Обычно эукариотические клетки, которые не остановились в фазе G₀, завершают цикл за 24 ч.

Роль циклинов и циклинзависимых киназ. Исследования митотического цикла показали, что ключевую роль в поочередной смене его фаз играют специальные протеинкиназы - т.е. циклинзависимые киназы (Cdks - cyclin-dependent kinasis). Каждая из них фосфорилирует определенные белки, вовлеченные в соответствующую фазу цикла, и таким образом активирует или ингибирует их.

Молекула любой Cdk состоит лишь из одной субъединицы, которая сама по себе неактивна. Для активации же Cdk требуется связывание с ней специального белка - циклина (Ц). Имеется несколько разных циклинов, и, как считают, связавшийся с Cdk циклин не только активирует фермент, но и придает ему субстратную специфичность в отношении тех или иных белков.

Термин циклин отражает тот факт, что концентрации циклинов в клетке в течение клеточного цикла изменяются циклическим образом (рис.43) .

В активной форме протеинкиназы представляют собой гетеродимерные комплексы циклин-Cdk (Ц-Cdk), где циклин служит активаторной, a Cdk - каталитической субъединицей. Данные образования не рассматривают как единые молекулы, а называют комплексами, из-за того, что могут быть разные сочетания конкретных циклинов и конкретных Cdk, причём каждое такое сочетание характерно для строго определённой фазы цикла.

Запускают цикл комплексы циклинD-Cdk4 и (или) циклинD-Cdk6. Разные циклины обозначаются латинскими буквами, а разные Cdk - арабскими цифрами. Названные комплексы функционируют на начальной стадии постмитотического (G₁) периода и, вызывая соответствующие внутриклеточные события, способствуют переходу клеткой «точки рестрикции» (точка, предшествующая S-периоду, т.е. для постоянно делящихся клеток находится где-то в конце G₁-периода, а для клетки, начинающей деление после перерыва, где-то в конце G_o -периода). Аналогично, те же комплексы приводят к возврату «спящей» G_o -клетки в митотический цикл.

Вторая половина G₁ -происходит под управляющим влиянием комплекса циклин E-Cdk2.

В следующем - синтетическом (S) - периоде функционирующая циклинзависимая киназа остаётся той же (Cdk2), но она дважды меняет своих циклиновых партнёров - ими последовательно становятся циклин А и циклин В. Соответственно, меняются и те белковые субстраты, на которые действуют Cdk2.

В премитотическом (G₂) периоде последний из вышеназванных циклинов (В) связывается с другой Cdk - Cdkl. Именно комплекс циклин B-Cdkl «вводит» клетку в митоз и «руководит» этим сложным процессом. Поэтому его еще называют митоз-стимулирующим фактором - MPF (от mitosis-promoting factor).

Из состава последних двух комплексов следует, что их субстратная специфичность определяется не только циклином, но и самой Cdk, а вернее всего – одновременно тем и другим, т.е. имеющимся сочетанием циклина с Cdk.

Cdk1 нередко обозначается иначе - Cdk2. Дело в том, что мутации гена Cdkl, нарушая клеточный цикл, вызывают у дрожжей фенотип вида Сdc2 (при котором клетки становятся необычайно длинными). Поэтому, ещё до идентификации функции этого гена, он был обозначен как Сdc2.

Рис.43. Схема динамики клеточного цикла

Итак, всё разнообразие событий клеточного цикла управляется относительно небольшим числом комплексов циклинов и Cdk.

Способы регуляции и активности Cdks. Ввиду исключительной функции циклинзависимых киназ (Cdks), их содержание и особенно активность находится под сложным контролем. Вот принципиальные способы этого контроля.

1. Регуляция синтеза Cdks. Видимо, не все Cdks одновременно присутствуют в клетке на разных стадиях её цикла. Поэтому очень важным моментом является активация гена той или иной Cdk.

Так, известно, что комплексы G₁ периода (циклин D-Cdk4,6 и циклин E-Cdk2), помимо других многочисленных действий, запускают транскрипцию гена киназы Cdkl. Последняя же необходима для образования комплекса G₂- периода и митоза (циклин B-Cdkl или MPF). Таким образом, о синтезе компонентов данного комплекса клетка «заботится» заблаговременно, ещё до репликации ДНК.

2. Регуляция активности Cdks. Способы этой регуляции достаточно разнообразны.

а) Один из них - связывание с какой-либо Cdk активаторной субъединицы - циклина.

б) Второй способ - связывание (либо только с Cdk , либо со всем комплексом циклин-Cdk) ингибиторной субъединицы. В роли последней выступают специальные белки (р15, р16, р21, р27, р57). Известно, по крайней мере, два семейства таких белков. Белки семейства INK4 (р15 и р16) связываются с Cdk4,6 и тем самым препятствуют образованию комплексов (циклин D-Cdk4,6), запускающих клеточный цикл. Белки второго семейства, KIP1 (р21,р27, р57), связываются с уже сформированными комплексами - и это тоже приводит к ингибирующему эффекту.

с) Третий способ контроля активности Cdks - это их фосфорилирование и дефосфорилирование. Т.е. данные протеинкиназы (Cdks) сами способны регулироваться тем же самым способом, каким они управляют активностью «подведомственных» им белков.

Фосфорилирование по одним локусам Cdk обладает активирующим действием; фосфорилирование других участков, напротив, ингибирует фермент.

Но активность киназ восстанавливается под действием специфической фосфатазы, кодируемой геном cdc25a. Из обозначения следует, что это ещё один ген, мутация которого у дрожжей приводит к нарушению клеточного цикла и фенотипу cdc.

Выявлены также две тирозинкиназы (ТК), ингибирующие другую Cdk - Cdkl; одна из этих ТК, видимо, действует на свободную Cdkl, a другая - на весь комплекс циклин В -Cdkl.

3.Регуляция синтеза и распада активаторов и ингибиторов Cdks. В качестве примера обратимся вначале к циклинам.

а) Многие митогенные факторы, «побуждая» клетку к делению, запускают такие регуляторные цепи, которые, в конце концов, активируют ген циклина D (помимо многих других действий). На следующих стадиях клеточного цикла стимулируется синтез очередных циклинов и т.д.

б) Крайне интересным является также управление распадом циклинов. Оно осуществляется с помощью убиквитин зависимого механизма, который используется для короткоживущих белков.

Наиболее чётко роль этого механизма показана для циклина В, участвующего в образовании комплекса циклин В - Cdk2 и митоз-стимулирующего фактора (MPF, он же комплекс циклин B-Cdkl). Фосфорилируя определённые белки, MPF стимулирует вхождение клетки в митоз. Но для завершения митоза необходимы во многом прямо противоположные события. Т.е. содержание MPF должно снижаться. Это достигается с помощью быстрого распада циклина В.

Примерная последовательность событий. Максимальной активности комплекс MPF достигает в метафазе митоза. В это время он фосфорилирует, помимо других белков, так называемый фактор АРС (аnaphase-promotoring complex) т.е. фактор, обеспечивающий анафазу. А данный фактор является ничем иным, как убиквитинлигазой, специфичной в отношении MPF. Поэтому он начинает последовательно присоединять (одну за другой) молекулы убиквитина к циклину В. Меченный таким образом циклин В быстро разрушается в протеосомах. В итоге содержание комплекса циклин B-Cdkl значительно снижается, и в клетке благополучно совершаются события анафазы, а затем и телофазы. Затем в G₁-периоде фактор АРС инактивируется, от чего скорость распада циклина В снижается, и данный циклин начинает накапливаться в клетке.

в) Контроль за синтезом веществ, ингибирующих Cdks (либо комплексы циклин-Cdk). Регуляция синтеза часто используется внеклеточными эффекторами для влияния на клеточный цикл - стимуляции или торможения пролиферации. Один из примеров: в некоторых регуляторных внутриклеточных цепочках фигурируют белки семейства Smad. Эти белки, образуя соответствующие транскрипционные факторы, стимулируют синтез ингибиторов р15, р21 и др. В итоге активность комплексов G₁-периода тормозится и клетка прекращает деление.

Принципы передачи митогенного сигнала. Практически все сигнальные пути, регулирующие пролиферацию клеток, «нацелены» на комплексы G₁-периода — в основном, циклин D—Cdk4,6 и, в меньшей сте­пени, циклин Е—Cdk2. Это и понятно: как уже отмечалось, именно данные комплексы «запускают» очередной клеточный цикл.

Рассмотрим два митогенных сиг­нальных пути. Один из них относится к стволовым клеткам эпителия и на­чинается со связывания ЭФР — эпидермального фактора роста.

Второй путь активируется в Т-хелперах после их взаимодействия с АПК — антигенпредставляющими клетками.

Теперь на этих же двух примерах покажем «выход» подоб­ных путей на комплексы циклин-Cdk.

В обоих случаях внешний сигнал приводит к активации тирозинкиназы, ассоциированной с рецептором. Это ведет (через те или иные посредники) к запуску ка­скадов митогенактивируемых протеинкиназ (МАПК). Конечные ферменты данного каскада, фосфорилируя ряд транскрипционных факторов (Elk, Ets, ATF2, Tcf и др.), активируют их, а через них — и т. н. гены раннего ответа (FOS, JUN). В культуре клеток уже через 30 мин после начала действия митогена активность этих генов достигает максимального уровня.

Продукты семейств генов FOS и JUN — это опять-таки транскрипционные факторы, но специфичные уже в отноше­нии других генов — т. н. генов замедленного ответа. Поэтому через некоторое время начинается экспрессия этих генов.

Среди последних-то и находятся наши «знакомые» — гены циклина D, Cdk4 и Cdk6, т.е. компонентов комплексов циклин-Cdk, специфичных для первой половины G1 - периода цикла.

Кроме того, активируются еще некоторые гены и среди них — ген белка Мус. После своего синтеза белок Мус, в свою очередь, влияет на активность ряда генов. Так, он тормозит экспрессию гена белка р27 — ингибитора целого ряда комплексов циклин- Cdk. И одно­временно белок Мус активирует ген Cdc25a, который кодирует специфическую фосфатазу. Послед­няя дефосфорилирует Cdk4 и Cdk2, что приводит к их активации.

В результате мы получаем следующие эффекты:

увеличение содержания в клетке циклина D и реагирующих с ним киназ — Cdk4, Cdk6;

снижение содержания ряда ингибиторов Cdks;

повышение активности (в результате дефосфорилирования) тех же циклинзависимых киназ (Cdk4, Cdk6), а также Cdk2.

Все это и обеспечивает формирование в клетке достаточно­го количества активных комплексов циклин D—Cdk4,6, начи­нающих подготавливать клетку к делению.

Заметим, чтобы рассмотренные сигнальные пути «сработа­ли», необходимо одно условие: клетка должна быть фиксирова­на на каком-либо внеклеточном матриксе.

Действие антимитогенов. Это действие ФНО (фактора некроза опухолей) на опухолевые клетки. ФНО «запускает» в клетках сразу несколько сиг­нальных путей, и среди них один содержит ферментативный каскад МАПК. Только теперь возбуждение соответствующего рецептора через ряд посредников (среди которых — сфингозин и ПК-С) приводит к торможению МАПК. Дальше — все как в предыдущих путях, но с противопо­ложным знаком. Следовательно, в итоге в клетке будет резко снижаться количество активных комплексов циклин D—Cdk4,6, в результате чего деления прекратятся. Действие же ФНО че­рез другие сигнальные пути будет ини­циировать апоптоз.

Второй пример: речь идет о ТФРр — трансформирующем факторе роста. Уже отмечалось, что он угнетает пролиферацию многих клеток. Рецепторы ТФРр, видимо, сходны по структуре с рецепто­рами ЭФР (эпидермального фактора роста). Это зна­чит, что при связывании своего лиганда рецепторные субъеди­ницы объединяются в димерные структуры, цитоплазматические домены каждой субъединицы обладают тирозинкиназной активностью, в активированном со­стоянии эти домены фосфорилируют друг друга. Отличие состоит лишь в том, что в данном случае модифицированные домены рецептора связывают иной комплекс цитоплазматических белков: теперь это комплекс Smad2+Smad3. Он тоже фосфорилируется рецепторной тирозинкиназой, после чего приобретает способность связы­вать третий белок — Smad4.

Затем весь этот тройной ком­плекс диффундирует в ядро и выполняет роль транскрипционно­го фактора для генов, кодирую­щих ингибиторы Cdks. Имеются в виду такие белки, как р15 и р21.

Накопление в клетке этих ингибиторов и приводит к торможению пролиферации.

Роль факторов роста, интегринов и кадгеринов. Клеткам низших организмов для вступления в S-фазу клеточного цикла необходимо наличие пи­тательных веществ во внешней среде. При недостатке питательных веществ клетка не делится. У высших организмов наличие питательных веществ обычно не является лимитирующим фактором. Однако сигнал, инициирующий деление клетки, чаще бы­вает внешним, чем внутренним. Доказательства этого были получены в первых экспериментах с культурой клеток млекопитающих in vitro.

При разработке методики выращивания клеток млекопитающих в культуре было отмечено, что клетки растут лучше, если они находятся внутри кровяных сгустков. Из-за неудобства исследова­ния растущих клеток внутри сгустка, после свер­тывания крови сгусток удаляется. Оставшаяся жидкость известна как сыворотка. Если удалить все клетки до того, как кровь свернется, и добавить полученную сыворотку к растущим клеткам, она не будет поддерживать рост. Это доказывает, что при свертывании из клеток крови высвобождается некий фактор, необходимый для деления клеток. Было показано, что это вещество высвобождает­ся из тромбоцитов, и оно было названо тромбоцитарным фактором роста (PDGF). Оказывается, нормальные клетки млекопитающих содержат дос­таточное количество питательных веществ для де­ления. Таким образом, в клетки должен поступать дополнительный сигнал, стимулирующий проли­ферацию. В случае с тромбоцитарным фактором роста этот белок секретируется тромбоцитами при свертывании крови после образовании раны. Для восполнения тканевого дефекта тромбоцитарный фактор роста, один из главных факторов роста ор­ганизма, сигнализирует окружающим клеткам о необходимости приступить к делению.

К настоящему времени выделено и охарактери­зовано большое число факторов роста: тромбоцитариый фактор роста; эпидермальный фактор роста (EGF); факторы роста фибробластов (FGF) (имеют девять изоформ и обладают небольшой кле­точной специфичностью, однако еще относятся к группе малоспецифичных); фактор роста нервов (NGF) (этот фактор роста действует только на клетки нервной системы); эритропоэтин (ЕРО) (этот фактор роста сти­мулирует образование эритроцитов в костном мозге); иитерлейкин-2 и интерлейкин-3.

Все эти факторы роста действуют в основном на специфические клетки-мишени. Каждый фактор роста является лигандом, который связывается со специфическим поверхностным рецептором клет­ки и инициирует процесс передачи сигнала.

Большинство клеток млекопитающих находится в особой фазе клеточного цикла, называемой G_o-фазой или компартментом клеточной дифференцировки. Эта фаза клеточного цикла представ­ляет собой удлиненную фазу G₁. Это означает, что гены, кодирующие белки, которые запускают про­лиферацию клеток, находятся в «выключенном» состоянии. В этом положении метаболическая энергия клетки расходуется на образование спе­циализированных белков, необходимых для осу­ществления дифференцировки. Таким образом, ге­ны, кодирующие эти белки, находятся во «вклю­ченном» состоянии.

В большинстве типов клеток гены для клеточ­ной пролиферации могут быть включены снова. Однако в некоторых клетках гены пролиферации никогда не запускаются повторно после выключе­ния. При завершении пролиферации в клетках сер­дечной мышцы Cdk и циклины выключаются и больше никогда не включаются. То же справедливо и для всех типов нейронов.

Однако в соответствующих условиях многие клетки могут вернуться в цикл деления. Практиче­ски во всех тканях организма происходят клеточные «превращения». Обычно такие превращения происходят редко. Исключение составляют клетки крови и кишечного эпителия, в которых скорость обновления клеток очень высока.

Как показано выше, один из основных типов сигналов, активирующих Cdk и циклины, генери­руют факторы роста. Однако, даже получив такой сигнал, организм должен регулировать ответ таким образом, чтобы поддерживать количество и про­странственную организацию клеток. Если этого не происходит, наступают летальные изменения орга­низма.

При исследовании нормальных клеток, выращен­ных в культуре ткани, было показано, что существу­ют различные факторы, определяющие число клеток, необходимых для поддержания архитектуры ткани, и качество соединения клеток с базальной мембраной. Если выращиваемые в культуре фибробласты заполняют всю чашку Петри, они перестают де­литься и, очевидно, уходят в псевдо-С_о-фазу. Если в стерильных условиях по поверхности культуры провести шпателем диагональную линию, клетки, расположенные на этой линии, погибают и остает­ся бесклеточная диагональ. Клетки, находящиеся на краю «раны», начинают немедленно делиться и пролиферировать, заполняя свободное пространст­во. Как только пространство заполнено, деление снова прекращается.

На основе этого наблюдения был сделан вывод о том, что нормальные клетки делятся до достиже­ния определенной плотности. После образования контактов с другими клетками на субстрате, внутрь клетки передается сигнал о том, что все контактные точки заняты, и гены, запускающие пролиферацию, выключаются.

Если клетке не давать соприкоснуться с поверх­ностью тарелки, она сохраняет округлую форму и не вступает в митоз. Если же клетка соприкасается с поверхностью и расплющивается, она формирует с поверхностью тарелки контакты, называемые фо­кальными контактами и фокальными адгезионны­ми пластинками. В состав фокальной ад­гезионной пластинки входят важные компоненты цитоскелета, включая актиновые филаменты, мик­ротрубочки и другие структурные белки. Спустя некоторое время эти клетки вступают в митоз.

Результаты этих и аналогичных экспериментов доказывают, что молекулы окружающей среды, на­пример входящие в состав межклеточных контак­тов и контактов клеток с межклеточным вещест­вом, участвуют в управлении клеточной пролифе­рацией.

Теперь рассмотрим такие сигнальные пути, которые начина­ются от адгезивных мембранных белков. Одни из этих путей сти­мулируют пролиферацию клеток; другие, наоборот, тормозят.

Многие клетки способны делиться, только будучи прикрепленными к внеклеточной структуре – базальной мембране (эпителиоциты), коллагеновым волокнам (фибробласты) и т.д.

Информация же о связи клетки с такой структурой посту­пает от интегринов. Это адгезивные белки с двумя неравными субъединицами.

При связывании с внеклеточным матриксом меньшая (р-) субъединица интегрина активирует одну из тирозинкиназ — FAK (Focal Adhesion Kinase), а та, в свою очередь, еще одну тирозинкиназу — Src. Последняя относится к классу нерецепторных тирозинкиназ, поскольку не входит в состав рецепторного комплекса и даже не взаимодействует напрямую с рецепторами.

Непосредственным субстратом Src является белок SHC, ко­торый связывает данный сигнальный путь (идущий от интегри­нов) с сигнальными путями от рецепторов митогенов. Общей же частью последних путей являются многократно упоминавшиеся выше каскады МАПК (митогенактивируемых протеинкиназ). Следовательно, адаптерный белок SHC должен стимулировать прохождение сигнала по данным каскадам.

Однако не вполне ясно, какой именно член каскадов акти­вируется белком SHC. Есть предположение, что это тот же ком­плекс белков (GRB, SOS, Ras, Raf), что и в случае действия ЭФР (эпидермального фактора роста).

Но, с нашей точки зрения, надо учесть следующее обстоя­тельство. Для того, чтобы клетка млекопитающих стала делить­ся, необходимо одновременное выполнение двух условий: прикрепление клетки к какой-либо поверхности и действие на нее ростового фактора.

Причем в неприкрепленной клетке прохождение сигнала от ростового фактора блокируется на одной из МАПК, а кон­кретно — на киназе МЕК (МЕК1).

Отсюда следует, что:

а) сигнал от интегринов идет именно к этому звену МАПК — киназе МЕК;

б) данная киназа активируется только при действии на нее сразу двух белков: предыдущей киназы из семейства МАПК и белка SHC (после действия на него Src).

Тогда и получается, что сигналы от ростового фактора и ин­тегринов взаимно дополняют друг друга, а каждый из них в от­дельности не способен индуцировать деление клетки.

Эффект прикрепления клетки к опоре включает еще одно важное событие. Оно касается «знаменитого» транскрипцион­ного фактора — белка р53.

Последний активирует гены, остана­вливающие деления (в частности, ген белка р21 — ингибитора комплексов циклин- Cdk), а также гены апоптоза. Поэтому не­удивительно, что идущий от интегринов сигнал приводит к сни­жению содержания в клетке такого «вредного» белка.

В случае белка р53 обычно регулируется не синтез, а рас­пад. Поэтому под действием сигнала от интегринов, видимо, тем или иным способом ускоряется протеолиз этого белка. По не­которым данным, это может быть связано со снижением содер­жания другого белка (ARF), ингибирующего распад белка р53.

Контактное торможение пролиферации. Если же клетка устанавливает контакт не с внеклеточным матриксом, а с другими клетками, то наблюдается эффект, прямо противоположный предыдущему, — прекращение деле­ний. Это обозначается как контактное торможение.

После очередного пересева клеток в плоский стеклянный сосуд («матрас») они вначале — в течение нескольких часов прикрепляются ко дну сосуда и лишь после этого входят в кле­точный цикл (стимуляция делений).

Когда же на дне сосуда не остается свободного места и клетки вступают в контакт друг с другом, деления прекращают­ся (контактное торможение).

Сигнал о межклеточном контакте, видимо, идет от кадгеринов — адгезивных белков, участвующих в образовании та­ких контактов. Вероятно, у кадгеринов меняется при этом конфигурация; поэтому их цитоплазматические до­мены приобретают способность связывать белок р-катенин.

Предполагают, что данный белок — транскрипционный фактор. Когда он свободен от связи с кадгерином (т. е. когда клетка еще не контактирует с другими клетками), он образует активный комплекс с еще одним транскрипционным факто­ром — белком Tcf4. Комплекс мигрирует в ядро и здесь прямым или (скорее всего) опосредованным способом стимулирует тран­скрипцию генов циклина D и белка Мус.

Это вновь те самые гены, которые активируются в ранее рассмотренных сигнальных путях — идущих от ростовых фак­торов и от интегринов. Те пути сходятся и взаимно дополняют друг друга на каскадах митогенактивируемых киназ (МАПК).

Но путь, содержащий β-катенин, тоже является необходи­мым для деления. При улавливании β-катенина кадгерином де­ления прекращаются. Следовательно, этот путь также необходимо дополняет предыдущие. С нашей точки зрения, все объясняется и встает на свои ме­ста при следующих предположениях:

• в начале любого клеточного цикла должен образоваться некий (всегда один и тот же) промитотический комплекс тран­скрипционных факторов (ПМКТФ), специфичный в отношении генов раннего ответа;

• в состав этого комплекса входят β-катенин и белок Tcf4, что возможно лишь тогда, когда β-катенин не связан кадгери­ном (нет межклеточных контактов);

• кроме того, комплекс содержит факторы, активируемые каскадом МАПК; причем этот каскад сам, по предыдущему на­шему предположению, требует двойного сигнала от интегринов (клетка прикреплена к внеклеточной структуре) и от росто­вого фактора.

В итоге число условий, необходимых для деления клетки (в принципе способной к делению), возрастает уже до трех: это не только прикрепление к поверхности и действие рос­тового фактора, но и отсутствие контактов с другими клетками.

Лишь при выполнении этих условий активируются гены раннего ответа, и запускается механизм клеточного цикла, в частности, образуется «вторая очередь» транскрипционных факторов, а затем и продукты стимулируемых ими генов — циклин D, Cdk4,6 и т. д.

Но этим перипетии внутриклеточных регуляторных путей, связанные с β-катенином, не исчерпываются. Установлено еще, по крайней мере, два интересных факта.

а) Деградация β-катенина производится с помощью убиквитинзависимого механизма. Причем в каче­стве убиквитинлигазы (фермента, переносящего убиквитин на Р-катенин) выступает уже знакомый нам фактор АРС, обеспечивающий анафазу.

Последний выполняет такую же функцию в отношении циклинов, необходимых для вхождения клетки в цикл. Поэтому нет ничего удивительного, что одновременно с данными циклинами разрушается и транскрипционный фактор, требую­щийся для их синтеза. Происходит же это в метафазе и анафазе митоза, когда АРС активируется путем фосфорилирования.

По некоторым данным, перед взаимодействием с АРС β-ка­тенин тоже должен подвергнуться фосфорилированию — киназой-ЗР-гликогенсинтетазы (GSK-3P), которая, в свою очередь, находится под контролем ряда белков.

Такое «повышенное внимание» со стороны клетки к β-катенину — косвенное свидетельство его ключевой роли в запуске деления. Это вполне согласуется с предположением, что β-кате­нин — необходимый компонент универсального транскрип­ционного комплекса, начинающего клеточный цикл при любом митогенном стимуле.

б) Второй факт состоит в том, что при контактном торможе­нии в клетке увеличивается содержание белка р53. Это тоже выглядит вполне естественно, если считать, что все тот же комплекс транскрипционных факторов, помимо про­чего, ускоряет распад белка р53, выключая ген белка ARF — инги­битора протеолиза белка р53.

Конечно, известно здесь еще далеко не все. Но о принципе работы и некоторых деталях этого замечательного механизма уже можно сказать.

Что касается принципа работы, то он достаточно прост и очевиден. Комплекс циклин-Cdk очередной стадии цикла, как правило, должен обеспечить три процесса:

а) «выведение из игры» комплекса предыдущей стадии,

б) стимуляцию событий «своей» стадии,

в) образование (или активацию) комплекса следующей стадии.

Получается своего рода «цепной» механизм, после включения, которого каждая стадия процесса подготавливает усло­вия для перехода к следующей стадии. Несомненно, таков же принцип многих других сложных биологических процессов — таких, как эмбриональное развитие, дифференцировка, реге­нерация.

Посмотрим теперь, как конкретно реализуется этот прин­цип в случае клеточного цикла.

Контрольные точки митотического цикла. (Белок р53, микротрубочки: связь с клиникой). Точная репликация и распределение генетиче­ского материала — это важнейшие условия выжива­ния клетки. В клеточном цикле существуют четыре точки, в которых точность репликации, правиль­ность последовательности и равное разделение ДНК контролируются специальными клеточными механизмами.

A. Контрольная точка фазы G₁. Если в фазе G₁ обнаруживается повреждение ДНК, белок р53 выступает в роли фактора транскрипции и вызыва­ет задержку клеток в G₁. Нестабильный р53 обыч­но быстро разрушается. Однако, когда в клетке по­является аномальная ДНК, белок р53 стабилизи­руется и присоединяется к этой ДНК. В результате р53 накапливается в ядре и стимулирует экспрес­сию белка, ингибирующего Cdk2.

Клетка задерживается в фазе G₁ до тех пор, пока поврежденные нуклеотиды не будут восстановле­ны ферментами репарации. Задержка в фазе G₁ предотвращает копирование поврежденных осно­ваний и тормозит мутацию ДНК. При отщеплении белка р53 от ДНК его концентрация снижается; ингибитор Cdk отделяется, и Cdk начинает экспрессироваться.

В клетках многих метастатических опухолей че­ловека оба аллеля р53 неактивны. В таких клетках нарушен нормальный контроль, осуществляемый р53, и поврежденная ДНК может реплицироваться. В некоторых случаях это приводит к метастатичес­кой трансформации опухолей.

Б. Контрольная точка S-фазы функциони­рует в фазе S, когда реплицируется ДНК. Появле­ние мутаций в процессе репликации и их после­дующее встраивание в геном может вызвать серь­езные последствия, включая гибель клетки. Если произошли ошибки в репликации, (что случается) и если они были пропущены репаративными фер­ментами, клетка не может выйти из S-фазы. Про­верка точной репликации ДНК — важнейшая регуляторная точка клетки.

B. Контрольная точка С₂-фазы. Нереплицированная ДНК блокирует переход клетки от С₂ -фазы к М-фазе. Происходит катастрофическое повре­ждение, если клетка проходит через фазу цикла, незавершив молекулярные процессы, необходимые для подготовки к делению. Например, при введе­нии MPF в клетки, находящиеся в S-фазе, неполно­стью реплицированные хромосомы конденсируют­ся, а затем фрагментируются.

Г. Контрольная точка М-фазы. Причиной остановки цикла в данной точке может быть неправильная сборка веретена деления. Например, неприкрепление кинетохоры какой- либо хроматиды к микротрубочкам веретена деления. Микротрубочки (МКТ) постоянно полимеризуются и деполимеризуются. Во время митоза происходят резкие и непредсказуемые переходы МКТ из растущего (полимеризация) в сокращающееся (деполимеризация) состояние - это катастрофа и обратно – это спасение. Медикаментозная терапия онкологических больных заключается в разрушении митотического веретена колхицином, винбластином и винкристином, которые нарушают полимеризацию МКТ.

В зависимости от результатов «проверки», выбирается один из трех вариантов:

а) безостановочный переход к следующей стадии цикла;

б) задержка на текущей стадии для исправления обнаруженных дефектов;

в) запуск механизма апоптоза, если выявленные нарушения неисправимы.

В большинстве, если не во всех, случаях хромосомных повреждений центральную роль в остановке цикла играет белок р53.

Роль белка р53 («Страж генома», «Диспетчер апоптоза», Опухолевый супрессор). Белок р53 контролирует исключительно важные клеточные процессы и, благодаря этому, вовлечен в большое количество всевозможных регуляторных цепей. Он (или его ген) активируется в ответ на разнообразные повреждения клеточной структуры: нерепарированные разрывы и другие повреждения ДНК, нарушение расхождения хромосом в митозе, разрушение микротрубочек и т. д.

Сам же белок р53 регулирует активность, по крайней мере, трех групп генов:

1) активирует гены (Р21, GADD45 и другие), отвечающие за остановку клеточного деления;

2) активирует гены (BAX, KILLER/DR5, PIG и другие), запускающие апоптоз – процесс, ведущий, путем активации специальных ферментов, к гибели клетки; а так же репрессирует гены (BCL2, RELA), сдерживающие апоптоз;

3) активирует гены (TSP1, BAI1 и другие), тормозящие ангиогенез (образование новых сосудов).

В итоге через посредничество белка р53 клетка в ответ на повреждение своей структуры

- либо задерживается на той или иной стадии митотического цикла и исправляет эти повреждения;

- либо (при невозможности исправлений) вообще прекращает деления и вступает в процесс клеточного старения (фаза III по Хейфлику);

- либо (при потенциальной опасности поврежденной клетки для ее окружения) осуществляет апоптоз, т. е., попросту говоря, самоубийство.

В частности, апоптозу, помимо прочих, подвергаются и клетки, в которых произошла опухолевая трансформация. В этой связи понятно, почему одновременно тормозится ангиогенез: это еще один способ ограничения опухолевого роста.

Поэтому белок р53 – один из наиболее важных опухолевых супрессоров. В большинстве уже развивающихся опухолей функции белка р53 оказываются в том или ином отношении нарушены.

Такова общая биологическая роль белка р53, а теперь рассмотрим некоторые связанные с ним вопросы более детально.

Белок р53 состоит из 392 аминокислот, образующих 6 доменов (рис. 44):

1) N-концевой домен активирует ген белка р21 (ингибитор киназ), а так же других белков, останавливающих деление клетки.

2) дополнительный транскрипционный домен для активации генов-мишеней.

3) гибкий пролиновый домен проявляет супрессорную активность, запускает апоптоз.

4) центральный домен связывается с энхансерами. В этом участке мутации 5-8 экзонов приводят к онкогенезу.

5) α-спиральный домен отвечает за ядерную локализацию р53 и образование тетрамеров (мономеры не активны).

6) С-концевой домен – мишень для модифицирующих ферментов (киназ, ацетилаз, гликозилаз).

Рис.44. Белок р53

Если С-концевой домен не модифицирован, центральный домен не способен взаимодействовать с ДНК-мишенью. Модификация же С-домена не только придает белку р53 такую способность, но и влияет на его специфичность. Дело в том, что р53-зависимые энхансеры (относящиеся к разным генам) несколько различаются последовательностью нуклеотидных пар. И от вида модификации С-домена зависит, с какими конкретно энхансерами будет связываться белок р53, а с какими – нет.

Таким образом, с помощью модификации двух концевых ( N- и С-) доменов белок р53 получает (от очень многочисленных «источников») информацию о состоянии клетки, перерабатывает ее путем изменения своей конфигурации и надлежащим образом реагирует как транскрипционный фактор определенных генов.

С-концевой домен выполняет еще одну функцию. Как отмечалось выше, некоторые гены (BCL2, RELA) белком р53 не активируются, а репрессируются. Это действие, как считают, осуществляется С-доменом. При этом последний (вместо N-домена) связывается с комплексом TFIID и подавляет его активность.

Апоптоз (Программированная гибель клеток). В Англии в Кембриджском университете в начале 60х годов Сидней Бреннер изучал нематоду Сaenorzhabditis elegans – 1мм длиной, прозрачна (видно деление клеток). Сотрудник его лаборатории Джон Салстон описал схему развития из яйцеклетки взрослого червя. При развитии нематоды образуется 1090 клеток, из которых 131 клетка идет в апоптоз, остается 959 клеток. Гены смерти, приводящие клетки к апоптозу, установил американец Роберт Хорвиц. Впоследствии, благодаря этим работам, они стали лауреатами Нобелевской премии в области молекулярной биологии.

Термин «апоптоз» появился в науке в 1972г. I. Kerr заимствовал его у Гиппократа, в переводе с греческого «апоптоз» – осенний листопад.

Апоптоз - программированная клеточная гибель, энергетически зависимый, генетически контролируемый процесс, который запускается специфическими сигналами и избавляет организм от ослабленных, ненужных или повреждённых клеток. В организме здорового человека клеточный гомеостаз определяется балансом между гибелью и пролиферацией клеток. Ежедневно, примерно около 5% клеток организма подвергаются апоптозу, а их место занимают новые клетки. В процессе апоптоза клетка исчезает бесследно в течение 15-120 минут. Апоптоз – это биохимически специфический тип гибели клетки, который характеризуется активацией нелизосомных эндогенных эндонуклеаз, которые расщепляют ядерную ДНК на маленькие фрагменты. Морфологически апоптоз проявляется гибелью единичных, беспорядочно расположенных клеток, что сопровождается формированием округлых, окруженных мембраной телец (“апоптотические тельца”), которые тут же фагоцитируются окружающими клетками.

Это энергозависимый процесс, посредством которого удаляются нежелательные и дефектные клетки организма. Он играет большую роль в морфогенезе и является механизмом постоянного контроля размеров органов. При снижении апоптоза происходит накопление клеток, пример – опухолевый рост. При увеличении апоптоза наблюдается прогрессивное уменьшение количества клеток в ткани, пример – атрофия.

Назначение апоптоза в клеточных популяциях можно сформулировать таким образом:

• поддержание численности клеток в популяции на заданном уровне;

• определение этого уровня и его изменение под влиянием внешних (по отношению к клетке) сигналов вплоть до полной элиминации данного типа клеток;

• селекция разновидностей клеток внутри популяции (в том числе элиминация клеток с генетическими дефектами).

Морфологические проявления апоптоза. Апоптоз имеет свои отличительные морфологические признаки, как на светооптическом, так и на ультраструктурном уровне. При окраске гематоксилином и эозином апоптоз определяется в единичных клетках или небольших группах клеток. Апоптотические клетки выглядят как округлые или овальные скопления интенсивно эозинофильной цитоплазмы с плотными фрагментами ядерного хроматина. Поскольку сжатие клетки и формирование апоптотических телец происходит быстро и также быстро они фагоцитируются, распадаются или выбрасываются в просвет органа, то на гистологических препаратах он обнаруживается в случаях его значительной выраженности. К тому же апоптоз – в отличие от некроза – никогда не сопровождается воспалительной реакцией, что также затрудняет его гистологическое выявление.

Апоптоз – это механизм гибели клеток, который имеет ряд биохимических и морфологических отличий от некроза (рис.45). Наиболее четко морфологические признаки выявляются при электронной микроскопии.

Рис.45. Изменение ультраструктуры клеток животных при некрозе и апоптозе: 1 – нормальная клетка, 2 – апоптотическое сморщивание клетки с образованием пузырчатых выростов, 3 – фрагментация клетки с образованием апоптотических везикул, 4 – набухание клетки при некрозе, 5 – некротическая дезинтеграция клетки.

Для клетки, подвергающейся апоптозу, характерно ее сжатие и конденсация хроматина.

Сжатие клетки. Клетка уменьшается в размерах; цитоплазма уплотняется; органеллы, которые выглядят относительно нормальными, располагаются более компактно. Предполагается, что нарушение формы и объема клетки происходит в результате активации в апоптотических клетках трансглютаминазы. Этот фермент вызывает прогрессивное образование перекрестных связей в цитоплазматических белках, что приводит к формированию своеобразной оболочки под клеточной мембраной, подобно ороговевающим клеткам эпителия.

Конденсация хроматина. Это наиболее характерное проявление апоптоза. Хроматин конденсируется по периферии, под мембраной ядра, при этом образуются четко очерченные плотные массы различной формы и размеров. Ядро же может разрываться на два или несколько фрагментов. Механизм конденсации хроматина изучен достаточно хорошо. Он обусловлен расщеплением ядерной ДНК в местах, связывающих отдельные нуклеосомы, что приводит к развитию большого количества фрагментов, в которых число пар оснований делится на 180-200. При электрофорезе фрагменты дают характерную картину лестницы. Эта картина отличается от таковой при некрозе клеток, где длина фрагментов ДНК варьирует. Фрагментация ДНК в нуклеосомах происходит под действием кальций чувствительной эндонуклеазы. Эндонуклеаза в некоторых клетках находится постоянно (например, в тимоцитах), где она активируется появлением в цитоплазме свободного кальция, а в других клетках синтезируется перед началом апоптоза. Однако еще не установлено, каким образом после расщепления ДНК эндонуклеазой происходит конденсация хроматина. Формирование в цитоплазме полостей и апоптотических телец. В апоптотической клетке первоначально формируются глубокие впячивания поверхности с образованием полостей, что приводит к фрагментации клетки и формированию окруженных мембраной апоптотических телец, состоящих из цитоплазмы и плотно расположенных органелл, с или без фрагментов ядра.

Фагоцитоз апоптотических клеток или телец осуществляется окружающими здоровыми клетками, или паренхиматозными, или макрофагами. Апоптотические тельца быстро разрушаются в лизосомах, а окружающие клетки либо мигрируют, либо делятся, чтобы заполнить освободившееся после гибели клетки пространство.

Фагоцитоз апоптотических телец макрофагами или другими клетками активируется рецепторами на этих клетках: они захватывают и поглощают апоптотические клетки. Один из таких рецепторов на макрофагах – рецептор витронектина, который является β3-интегрином и активирует фагоцитоз апоптотических нейтрофилов.

Апоптоз принимает участие в следующих физиологических и патологических процессах:

• запрограммированном разрушении клеток во время эмбриогенеза (включая имплантацию, органогенез). Несмотря на то, что при эмбриогенезе апоптоз не всегда является отражением “запрограммированной смерти клетки”, это определение апоптоза широко используют различные исследователи,

• гормон-зависимой инволюции органов у взрослых, например, отторжение эндометрия во время менструального цикла, атрезии фолликулов в яичниках в менопаузе и регрессия молочной железы после прекращения лактации,

• удалении некоторых клеток при пролиферации клеточной популяции,

• гибели отдельных клеток в опухолях, в основном при ее регрессии, но также и в активно растущей опухоли,

• гибели клеток иммунной системы, как В-, так и Т-лимфоцитов, после истощения запасов цитокинов, а также гибели аутореактивных Т-клеток при развитии в тимусе,

• патологической атрофии гормон - зависимых органов, например, атрофии предстательной железы после кастрации и истощении лимфоцитов в тимусе при терапии глюкокортикоидами,

• патологической атрофии паренхиматозных органов после обтурации выводных протоков, что наблюдается в поджелудочной и слюнных железах, почках,

• гибели клеток, вызванных действием цитотоксических Т-клеток, например, при отторжении трансплантата и болезни “трансплантат против хозяина”,

• повреждении клеток при некоторых вирусных заболеваниях, например, при вирусном гепатите, когда фрагменты апоптотических клеток обнаруживаются в печени, как тельца Каунсильмана,

• гибели клеток при действии различных повреждающих факторов, которые способны вызвать некроз, но действующих в небольших дозах, например, при действии высокой температуры, ионизирующего излучения, противоопухолевых препаратов.

Молекулярные механизмы апоптоза. Апоптоз – многоэтапный процесс. Первый этап – прием сигнала, предвестника гибели в виде информации, поступающей к клетке извне или возникающей в недрах самой клетки. Сигнал воспринимается рецептором и подвергается анализу.

Далее через рецепторы или их сочетания полученный сигнал последовательно передается молекулам-посредникам (мессенджерам) различного порядка и в конечном итоге достигает ядра, где и происходит включение программы клеточного самоубийства путем активации летальных и/или репрессии антилетальных генов. Однако существование ПКС (программируемая клеточная смерть) в безъядерных системах (цитопластах – клетках, лишенных ядра) показывает, что наличие ядра не является обязательным для реализации процесса.

Применительно к клеткам животных и человека апоптоз в большинстве случаев связан с протеолитической активацией каскада каспаз – семейства эволюционно консервативных цистеиновых протеаз, которые специфически расщепляют белки после остатков аспарагиновой кислоты.

На основе структурной гомологии каспазы подразделяются на подсемейства:

а) каспазы-1 (каспазы 1, 4, 5),

б) каспазы-2 (каспаза-2),

в) каспазы-3 (каспазы 3, 6–10) .

Цистеиновые протеазы, по-видимому, участвуют также в ПКС у растений. Однако апоптоз возможен и без участия каспаз: сверхсинтез белков-промоторов апоптоза Bax и Bak индуцирует ПКС в присутствии ингибиторов каспаз.

В результате действия каспаз происходит:

• активация прокаспаз с образованием каспаз;

• расщепление антиапоптозных белков семейства Bcl-2. Подвергается протеолизу ингибитор ДНКазы, ответственный за фрагментацию ДНК. В нормальных клетках апоптозная ДНКаза CAD (caspase-activated DNase) образует неактивный комплекс с ингибитором CAD, обозначаемым ICAD. При апоптозе ингибитор ICAD с участием каспаз 3 или 7 инактивируется, и свободная CAD, вызывая межнуклеосомальные разрывы хроматина, ведет к образованию фрагментов ДНК с молекулярной массой, кратной молекулярной массе ДНК в нуклеосомных частицах – 180-200 пар нуклеотидов. Апоптоз возможен и без фрагментации ДНК. Обнаружен ядерный белок Acinus (apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus), из которого при комбинированном действии каспазы-3 и неидентифицированной протеазы образуется фрагмент. Этот фрагмент в присутствии дополнительных неядерных факторов вызывает апоптотическую конденсацию хроматина и фрагментацию ядра (кариорексис) без фрагментации ДНК;

• гидролиз белков ламинов, армирующих ядерную мембрану. Это ведет к конденсации хроматина;

• разрушение белков, участвующих в регуляции цитоскелета;

• инактивация и нарушение регуляции белков, участвующих в репарации ДНК, сплайсинге мРНК, репликации ДНК.

Мишенью каспаз является поли(ADP-рибозо)полимераза (ПАРП). Этот фермент участвует в репарации ДНК, катализируя поли(ADP-рибозилирование) белков, связанных с ДНК. Донором ADP-рибозы является NAD+. Активность ПАРП возрастает в 500 раз и более при связывании с участками разрыва ДНК. Апоптотическая гибель клетки сопровождается расщеплением ПАРП каспазами. Чрезмерная активация ПАРП при массированных разрывах ДНК, сильно снижая содержание внутриклеточного NAD+, ведет к подавлению гликолиза и митохондриального дыхания и вызывает гибель клетки по варианту некроза.

Пути реализации программы ПКС (программируемая клеточная смерть).

1. Среди них важное место занимает путь, опосредованный физиологическими индукторами, действие которых реализуется через клеточные рецепторы плазматической мембраны, специально предназначенные для включения программы апоптоза. Этот путь передачи сигнала ПКС схематически можно изобразить следующим образом: индукторы ’ рецепторы ’ адаптеры ’ каспазы первого эшелона ’ регуляторы ’ каспазы второго эшелона. Так, рецептор, обозначаемый Fas, взаимодействуя с соответствующим лигандом (лигандом FasL), трансмембранным белком Т-киллера, активируется и запускает программу смерти клетки, инфицированной вирусом. Тем же путем при взаимодействии с лигандом FasL на поверхности ТН-1-лимфоцитов или с антителом к Fas-рецептору погибают ставшие ненужными выздоровевшему организму В-лимфоциты, продуценты антител, несущие Fas-рецептор. FasL– лиганд, относящийся к многочисленному семейству фактора некроза опухолей TNF. Это семейство гомотримерных лигандов, кроме FasL и TNFa , включает TNFb (лимфотоксин).

Fas – член семейства рецепторов TNF. Все они представлены трансмембранными белками, которые внеклеточными участками взаимодействуют с тримерами лигандов-индукторов. И их взаимодействие запускает в клетке- мишени процесс апоптоза. Тому же способствует и белок перфорин, который выделяется Т-киллерами и образует каналы в мембране клетки-мишени: через эти каналы в клетку проникают протеолитические ферменты гранзимы. Это так называемый инструктивный апоптоз, который абсолютно необходим для нормальной работы иммунной системы млекопитающих. Ключевыми молекулами инструктивного апоптоза являются рецепторы смерти. Лиганды рецепторов смерти представляют собой триммеры. Триммер лиганда связывается с тремя молекулами рецептора, вызывая его триммеризацию. Рецептор имеет цитоплазматический хвост, содержащий домены смерти. От них сигнал поступает к адапторным белкам, которые активируют каспазы – ферменты апоптоза (рис.46.).

Одним из наиболее изученных рецепторов смерти является рецептор Fas, воспринимающий сигнал, который доходит каспазы – 8. Он инициирует апоптоз, активируя другие каспазы – эффекторные. Эти каспазы разрушают клеточные структуры. Таким образом, каспаза – 8 + каспазы–эффекторные это «орудия» апоптоза, а ядерные и цитоплазматические белки – «мишени» каспаз.

Fas и его лиганд (Fas-L) – важные эффекторные молекулы. Ими обладают и используют их цитотоксические иммуноциты в защитной реакции против раковых клеток и клеток, пораженных вирусами.

Чтобы не допустить несвоевременный апоптоз, передачу сигнала через рецепторы смерти контролируют ряд клеточных механизмов:

существуют специальные белки, препятствующие спонтанной агрегации молекул рецептора;

существуют рецепторы-приманки, не содержащие полноценного домена смерти или лишенные цитоплазматического хвоста.

Fas и его лиганд также важны для элиминации активированных иммуноцитов, попавших в иммуннопривилегированные органы – семенники и глаза.

Взаимодействие рецептора и лиганда приводит к образованию кластеров рецепторных молекул и связыванию их внутриклеточных участков с адаптерами.

Адаптер, связавшись с рецептором, вступает во взаимодействие с эффекторами, пока еще неактивными предшественниками протеаз из семейства каспаз первого эшелона (инициирующих каспаз).

Взаимодействие адаптера с рецептором и эффектором осуществляется через гомофильные белок-белковые взаимодействия небольших доменов: DD (death domain – домен смерти), DED (death-effector domain – домен эффектора смерти), CARD (– домен активации и рекрутирования каспазы). Все они имеют сходную структуру, содержат по шесть a-спиральных участков. Домены DD(домен смерти) участвуют во взаимодействии рецептора Fas c адаптером FADD (Fas-associated DD-protein). Домены DED участвуют во взаимодействии адаптера FADD с прокаспазами 8 и 10.

Рис.46. Общая схема передачи сигнала через рецепторы смерти.

Наиболее подробно охарактеризована прокаспаза-8, рекрутируемая рецептором Fas через адаптeр FADD. Образуются агрегаты FasL – Fas – FADD – прокаспаза-8. Подобные агрегаты, в которых происходит активация каспаз, названы апоптосомами, апоптозными шаперонами, или сигнальными комплексами, индуцирующими смерть.

Прокаспазы обладают незначительной протеолитической активностью, составляющей 1–2% активности зрелой каспазы. Будучи в мономерной форме, прокаспазы, концентрация которых в клетке ничтожна, находятся в латентном состоянии. Предполагается, что пространственное сближение молекул прокaспаз при их агрегации ведет к образованию активных каспаз через механизм протеолитического само- и перекрестного расщепления (ауто- или транс-процессинга). В результате от прокаспазы (молекулярная масса 30–50 кДа) отделяется регуляторный N-концевой домен (продомен), а оставшаяся часть молекулы разделяется на большую (~20 кДа) и малую (~10 кДа) субъединицы. Затем происходит ассоциация большой и малой субъединиц. Два гетеродимера образуют тетрамер с двумя каталитическими участками, действующими независимо друг от друга. Таким образом, прокаспаза-8 активируется и высвобождается в цитоплазму в виде каспазы-8. Существуют другие пути активации каспазы-8 – с участием рецепторов TNFR1 и DR3.

На этапе активации каспаз первого эшелона жизнь клетки еще можно сохранить. Существуют регуляторы, которые блокируют или, напротив, усиливают разрушительное действие каспаз первого эшелона. К ним относятся белки Bcl-2 (ингибиторы апоптоза: A1, Bcl-2, Bcl-W, Bcl-XL, Brag-1, Mcl-1 и NR13) и Bax (промоторы апоптоза: Bad, Bak, Bax, Bcl-XS, Bid, Bik, Bim, Hrk, Mtd). Эти белки эволюционно консервативны: гомолог Bcl-2 обнаружен даже у губок, у которых апоптоз необходим для морфогенеза.

Каспаза-8 активирует каспазу второго эшелона (эффекторную каспазу): путем протеолиза из прокаспазы-3 образуется каспаза-3, после чего процесс, запущенный программой смерти, оказывается необратимым.

Каспаза-3 способна в дальнейшем к самостоятельной активации (автокатализу или автопроцессингу), активирует ряд других протеаз семейства каспаз, активирует фактор фрагментации ДНК, ведет к необратимому распаду ДНК на нуклеосомальные фрагменты. Так запускается каскад протеолитических ферментов, осуществляющих апоптоз.

2. Второй путь реализации программы ПКС связан с митохондриальным цитохромом c. В клетках, подвергшихся воздействию индуктора апоптоза, резко снижается мембранный потенциал (Dy) митохондрий. Падение Dy обусловлено увеличением проницаемости внутренней мембраны митохондрий вследствие образования гигантских пор. Существует много факторов, вызывающих раскрытие пор. К ним относятся истощение клеток восстановленным глутатионом, NAD(P)H, ATP и ADP, образование активных форм кислорода, разобщение окислительного фосфорелирования протонофорными соединениями, увеличение содержания Ca²⁺ в цитоплазме. Образование пор в митохондриях можно вызвать церамидом, NO, каспазами, амфипатическими пептидами, жирными кислотами. Поры имеют диаметр 2,9 нм, позволяющий пересекать мембрану веществам с молекулярной массой 1,5 кДа и ниже. Следствием раскрытия пор является набухание митохондриального матрикса, разрыв наружной мембраны митохондрий и высвобождение растворимых белков межмембранного объема. Среди этих белков – ряд апоптогенных факторов: цитохром с, прокаспазы 2, 3 и 9, белок AIF (apoptosis inducing factor), представляющий собой флавопротеин с молекулярной массой 57 кДа.

Образование гигантских пор не является единственным механизмом выхода межмембранных белков митохондрий в цитоплазму. Предполагается, что разрыв наружной мембраны митохондрий может быть вызван гиперполяризацией внутренней мембраны. Возможен и альтернативный механизм, без разрыва мембраны, – раскрытие гигантского белкового канала в самой наружной мембране, способного пропускать цитохром с и другие белки из межмембранного пространства.

Высвобождаемый из митохондрий цитохром с вместе с цитоплазматическим фактором APAF-1 (apoptosis protease activating factor-1) участвует в активации каспазы-9. APAF-1 – белок с молекулярной массой 130 кДа, содержащий CARD-домен (caspase activation and recruitment domain) образует комплекс с прокаспазой-9 в присутствии цитохрома с и dATP или АТР. Из этих субъединиц собираются жесткие, симметричные структуры, наподобие веера или пропеллера. APAF-1 играет роль арматуры, на которой происходит аутокаталитический процессинг каспазы-9. Предполагается, что в результате зависимого от гидролиза dATP (или АТР) конформационного изменения APAF-1 приобретает способность связывать цитохром с (рис.47). Связав цитохром с, APAF-1 претерпевает дальнейшее конформационное изменение, способствующее его олигомеризации и открывающее доступ CARD-домена APAF-1 для прокаспазы-9, которая тоже содержит CARD-домен. Так образуется конструкция, называемая также апоптосомой, с молекулярной массой > 1,3 млн дальтон, в составе которой – не менее 8 субъединиц APAF-1. Благодаря гомофильному CARD-CARD-взаимодействию с APAF-1 в эквимолярном соотношении связывается прокаспаза-9, а затем прокаспаза-9 связывает прокаспазу-3. Пространственное сближение молекул прокаспазы-9 на мультимерной арматуре из APAF-1-цитохром-с-комплексов, по-видимому, приводит к межмолекулярному протеолитическому процессингу прокаспазы-9 с образованием активной каспазы-9. Зрелая каспаза-9 затем расщепляет и активирует прокаспазу-3.

Рис.47. Флавопротеин - митохондриальный эффектор апоптоза у животных

Флавопротеин AIF, будучи добавленным, к изолированным ядрам из клеток HeLa, вызывает конденсацию хроматина и фрагментацию ДНК, а при добавлении к изолированным митохондриям печени крыс (высвобождение цитохрома с и каспазы) AIF является митохондриальным эффектором ПКС, действующим независимо от каспаз (рис.47).

Кроме рассмотренных компонентов, при нарушении наружной мембраны митохондрий из межмембранного объема выделяется термолабильный фактор, вызывающий необратимое превращение ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу. Ксантиндегидрогеназа катализирует зависимое от NAD+ окисление ксантина до гипоксантина и последующее окисление гипоксантина до мочевой кислоты. Ксантиноксидаза катализирует те же реакции, но не с NAD+, а с О₂ в качестве акцептора электронов. При этом образуются О₂A, Н₂О₂, а из них – и другие активные формы кислорода (АФК), которые разрушают митохондрии и являются мощными индукторами апоптоза. Механизмы образования АФК, конечно, не ограничиваются ксантиноксидазной реакцией. Главным источником АФК в клетках являются митохондрии. Резкое увеличение АФК происходит при возрастании мембранного потенциала в митохондриях, когда снижено потребление ATP и скорость дыхания лимитируется ADP . Цитоплазматическая мембрана макрофагов и нейтрофилов содержит О₂A – генерирующую NADPH-оксидазу.

В зависимости от пути, по которому осуществляется активация каспаз, различают разные типы клеток. Клетки типа I (в частности, линия лимфобластоидных В-клеток SKW и T-клетки линии Н9) подвергаются ПКС по пути, зависимому от апоптозных рецепторов плазматической мембраны без участия митохондриальных белков. Клетки типа II (например, линии Т-клеток Jurkat и СЕМ) погибают по пути апоптоза, зависимому от митохондриального цитохрома с. ПКС, вызванная химиотерапевтическими соединениями, УФ- или і-облучением, по-видимому, напрямую связана с апоптозной функцией митохондрий.

Некоторые клетки, например, клетки эмбриональной нервной системы, включают механизмы апоптоза, если они испытывают дефицит апоптозподавляющих сигналов (называемых также факторами выживания) от других клеток. Физиологический смысл процесса – в элиминации избыточных нервных клеток, конкурирующих за ограниченный фонд факторов выживания. Эпителиальные клетки при отделении от внеклеточного матрикса, вырабатывающего факторы выживания, тоже обречены на ПКС. Факторы выживания связываются соответствующими цитоплазматическими рецепторами, активируя синтез подавляющих апоптоз агентов и блокируя стимуляторы апоптоза. Некоторые вещества (например, стероидные гормоны) оказывают дифференцированный эффект на различные типы клеток – предотвращают апоптоз одних типов клеток и индуцируют его у других. Так, при наличии во внеклеточном матриксе факторов роста PDGF (platelet-derived growth factor – тромбоцитарный фактор роста) или NGF (nerve growth factor – фактор роста нервов) и цитокина интерлейкина-3 (IL-3) проапоптозный белок Bad не активен.Факторы роста, связавшись со своим рецептором на плазматической мембране, вызывают активацию цитозольной протеинкиназы В, и катализирующей фосфорилирование Bad по Ser-136. IL-3 тоже связывается со своим рецептором на плазматической мембране и активирует митохондриальную cAMP-зависимую протеинкиназу А, катализирующую фосфорилирование Bad по Ser-112. Будучи фосфорилированным по обоим остаткам серина, Bad образует комплекс с белком 14-3-3, располагающийся в цитоплазме. Дефицит факторов роста и IL-3 воспринимается клеткой как сигнал к апоптозу: происходит дефосфорилирование Bad, его внедрение в наружную мембрану митохондрий, выход цитохрома с из митохондрий и последующая активация каспазы-9 через APAF-1-зависимый механизм.

В ряде случаев ПКС реализуется в результате комбинированного действия двух путей – с участием и рецепторов плазматической мембраны, и митохондриального цитохрома с. Так, повреждение ДНК ведет к накоплению в клетке белкового продукта гена р53, который может останавливать деление клеток и/или индуцировать апоптоз. Белок р53 является фактором транскрипции, регулирующим активность ряда генов. Предполагается, что ответная реакция на образование белка р53 зависит от степени нарушения клеточного генома. При умеренном нарушении генома происходит остановка клеточного деления, осуществляется репарация ДНК, и клетка продолжает свое существование. При чрезмерном нарушении генома, когда ДНК уже не поддается репарации, включаются рецепторный и цитохром с-зависимый апоптозные каскады активации каспаз.

Также существует путь передачи сигнала ПКС с участием эндоплазматического ретикулума (ЭР). В ЭР локализована прокаспаза-12. Нарушение внутриклеточного Ca2+-гомеостаза добавкой тапсигаргина или Ca²⁺ -ионофорного антибиотика А23187 ведет к апоптозу клеток, вызванному превращением прокаспазы-12 в каспазу-12. ЭР-зависимый апоптоз связан с болезнью Альцгеймера.

Цитотоксические лимфоциты, Т-киллеры, могут вызывать апоптоз у инфицированных клеток с помощью белка перфорина. Полимеризуясь, перфорин образует в цитоплазматической мембране клетки-мишени трансмембранные каналы, по которым внутрь клетки поступают TNFb, гранзимы (фрагментины) – смесь сериновых протеаз. Существенным компонентом этой смеси является гранзим В – протеолитический фермент, превращающий прокаспазу-3 в активную каспазу-3 .

Взаимодействие клеток с внеклеточным матриксом осуществляется с помощью интегринов. Интегрины – большое семейство гетеродимерных мембранных белков, которые участвуют в адгезии клеток, связывая внутриклеточный цитоскелет с лигандами внеклеточного матрикса. Нарушение адгезии клеток индуцирует апоптоз.

Особую форму апоптоза претерпевают эритроциты млекопитающих. Биогенез эритроцитов из плюрипотентной стволовой клетки в костном мозге включает ряд промежуточных этапов. На этапе эритробласта ядро изгоняется (выталкивается) из клетки и пожирается макрофагом. Альтернативный вариант: кариорексис (деструкция ядра) с образованием телец Жолли и их последующий распад и лизис внутри клетки. Безъядерная клетка, называемая ретикулоцитом, в дальнейшем теряет митохондрии и рибосомы и превращается в эритроцит. Потерю ядра эритробластом можно рассматривать как особую форму ядерного апоптоза. Выяснение его механизма позволило бы применить его для обезвреживания опухолевых клеток.

Регуляция апоптоза. Апоптоз это генетически контролируемая смерть клетки. В настоящее время выявлено большое число генов, которые кодируют вещества, необходимые для регуляции апоптоза. Многие из этих генов сохранились в ходе эволюции - от круглых червей до насекомых и млекопитающих. Некоторые из них обнаруживаются также в геноме вирусов. Таким образом, основные биохимические процессы апоптоза в разных экспериментальных системах (исследования ведутся на круглых червях и мухах) являются идентичными, поэтому результаты исследований можно прямо переносить на другие системы (например, организм человека).

Апоптоз может регулироваться:

• внешними факторами,

• автономными механизмами.

Воздействие внешних факторов. Апоптоз может регулироваться действием многих внешних факторов, которые ведут к повреждению ДНК. При невосстановимом повреждении ДНК путем апоптоза происходит элиминация потенциально опасных для организма клеток. В данном процессе большую роль играет ген супрессии опухолей р53. К активации апоптоза также приводят вирусные инфекции, нарушение регуляции клеточного роста, повреждение клетки и потеря контакта с окружающими или основным веществом ткани. Апоптоз – это защита организма от персистенции поврежденных клеток, которые могут оказаться потенциально опасными для многоклеточного организма. При стимуляции тканей каким-либо митогеном ее клетки переходят в состояние повышенной митотической активности, которая обязательно сопровождается некоторой активацией апоптоза. Судьба дочерних клеток (выживут они или подвергнутся апоптозу) зависит от соотношения активаторов и ингибиторов апоптоза: - ингибиторы включают факторы роста, клеточный матрикс, половые стероиды, некоторые вирусные белки; - активаторы включают недостаток факторов роста, потерю связи с матриксом, глюкокортикоиды, некоторые вирусы, свободные радикалы, ионизирующую радиацию.

При воздействии активаторов или отсутствии ингибиторов происходит активация эндогенных протеаз и эндонуклеаз. Это приводит к разрушению цитоскелета, фрагментации ДНК и нарушению функционирования митохондрий. Клетка сморщивается, но клеточная мембрана остается интактной, однако повреждение ее приводит к активации фагоцитоза. Погибшие клетки распадаются на небольшие, окруженные мембраной, фрагменты, которые обозначаются как апоптотические тельца. Воспалительная реакция на апоптотические клетки не возникает.

Автономный механизм апоптоза. При развитии эмбриона различают три категории автономного апоптоза: морфогенетический, гистогенетический и филогенетический.

Морфогенетический апоптоз участвует в разрушении различных тканевых зачатков. Примерами являются:

• разрушение клеток в межпальцевых промежутках;

• гибель клеток приводит к разрушению избыточного эпителия при слиянии небных отростков, когда формируется твердое небо.

• гибель клеток в дорсальной части нервной трубки во время смыкания, что необходимо для достижения единства эпителия двух сторон нервной трубки и связанной с ними мезодермы.

Гистогенетический апоптоз наблюдается при дифференцировке тканей и органов, что наблюдается, например, при гормональнозависимой дифференцировке половых органов из тканевых зачатков. Так, у мужчин клетками Сертоли в яичках плода синтезируется гормон, который вызывает регрессию протоков Мюллера (из которых у женщин формируются маточные трубы, матка и верхняя часть влагалища) путем апоптоза.

Филогенетический апоптоз участвует в удалении рудиментарных структур у эмбриона, например, пронефроса.

При различных состояниях может наблюдаться как ускорение, так и замедление апоптоза. Несмотря на то, что апоптоз могут активировать различные факторы, характерные для определенных типов клеток, однако конечный путь апоптоза регулируется точно установленными генами и является общим, независимо от причины активации апоптоза. Все факторы, усиливающие или ослабляющие апоптоз, могут действовать прямо на механизм гибели клетки или опосредованно, путем влияния на регуляцию транскрипции. В некоторых случаях влияние этих факторов на апоптоз является решающим (например, при глюкокортикоид- зависимом апоптозе тимоцитов), а в других не имеет особой важности (например, при Fas- и TNF-зависимом апоптозе). В процессе регуляции принимает участие большое количество веществ. Наиболее изученными из них являются вещества из семейства bcl-2. Bcl-2 ген впервые был описан как ген, который транслоцируется в клетках фолликулярной лимфомы и ингибирует апоптоз. При дальнейших исследованиях оказалось, что Bcl-2 является мультигеном, который обнаруживается даже у круглых червей. Гомологичные гены были также обнаружены в некоторых вирусах. Все вещества, относящиеся к данному классу, делятся на активаторы и ингибиторы апоптоза.

К ингибиторам относятся: bcl-2, bcl-xL, Mcl-1, bcl-w, аденовирусный E1B 19K, Эпштейн-Барр-вирусный BHRF1. К активаторам относятся bax, bak, Nbk/Bik1, Bad, bcl-xS. Члены этого семейства взаимодействуют друг с другом. Одним из уровней регуляции апоптоза является взаимодействие белок-белок. Белки семейства bcl-2 формируют как гомо- так и гетеродимеры. Например, bcl-2-ингибиторы могут образовать димеры bcl-2-активаторами. Таким образом, жизнеспособность клеток зависит от соотношения активаторов и ингибиторов апоптоза. Например, bcl-2 взаимодействует с bax; при преобладании первого жизнеспособность клетки повышается, при избытке второго – уменьшается. К тому же белки семейства bcl-2 могут взаимодействовать с белками, не относящимися к этой системе. Например, bcl-2 может соединятся с R-ras, который активирует апоптоз. Другой белок, Bag-1, усиливает способность bcl-2 ингибировать апоптоз.

В настоящее время принято считать, что гены, участвующие в регуляции роста и развития опухолей (онкогены и гены-супрессоры опухолей), играют регулирующую роль в индукции апоптоза. К ним относятся:

• bcl-2 онкоген, который ингибирует апоптоз, вызванный гормонами и цитокинами, что приводит к повышению жизнеспособности клетки;

• белок bax (также из семейства bcl-2) формирует димеры bax-bax, которые усиливают действие активаторов апоптоза. Отношение bcl-2 и bax определяет чувствительность клеток к апоптотическим факторам и является “молекулярным переключателем”, который определяет, будет ли происходить рост или атрофия ткани;

• c-myc онкоген, чей белковый продукт может стимулировать либо апоптоз, либо рост клеток (при наличии других сигналов выживания, например, bcl-2);

• ген р53, который в норме активирует апоптоз, но при мутации или отсутствии (что обнаружено в некоторых опухолях) повышает выживаемость клеток. Установлено, что р53 необходим для апоптоза при повреждении клетки ионизирующим излучением, однако при апоптозе, вызванном глюкокортикоидами и при старении, он не требуется.

Снижение апоптоза. Продукт р53 гена следит за целостностью генома при митозе. При нарушении целостности генома клетка переключается на апоптоз. Наоборот, белок bcl-2 ингибирует апоптоз. Таким образом, недостаток р53 или избыток bcl-2 приводит к накоплению клеток: эти нарушения наблюдаются в различных опухолях.

Ослабление апоптоза вызывает патологические процессы. Например, приводит к образованию злокачественной опухоли. Сначала мутации 5-8 экзонов гена р53, который обычно трансформирует с нерепарированных разрывах цепей ДНК в сигнал к развитию апоптоза, что приводит к элиминации клеток с потерей ДНК. В нормальных клетках белок р53 не выявляется, а при опухолях его мутантную форму экспрессируют до 70% клеток. Без контроля гена р53 опухолевые клетки прогрессируют.

Изменения гена р53, гиперэкспресия еще двух генов (Вс1-1, Вс1-х), активация каспаз являются основой формирования устойчивости к лечебным воздействиям, которая основана на индукции апоптоза опухолевых клеток – рентгено- и радиотерапии, химиопрепаратам.

В итоге – возникает множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток.

Изучение факторов регулирующих апоптоз имеет большое значение в разработке лекарственных препаратов, усиливающих гибель клеток злокачественных новообразований. Аутоиммунные заболевания могут отражать нарушения в индукции апоптоза лимфоидных клеток, способных реагировать с собственными антигенами. Например, при системной красной волчанке наблюдается нарушение Fas-рецепторов на клеточной поверхности лимфоцитов, что ведет к активации апоптоза. Некоторые вирусы повышают свою выживаемость путем ингибирования апоптоза инфицированных клеток, например, вирус Эпштейна-Барра может воздействовать на обмен bcl-2.

Усиление апоптоза. Ускорение апоптоза доказано при синдроме приобретенного иммунодефицита (СПИД), нейротрофических заболеваниях и некоторых заболеваниях крови, при которых наблюдается дефицит каких-либо форменных элементов. При СПИДе вирус иммунодефицита может активировать CD4 рецептор на неинфицированных Т-лимфоцитах, ускоряя, таким образом, апоптоз, что приводит к истощению клеток данного типа.

Значение апоптоза в развитии организма и патологических процессах. Апоптоз играет важную роль в развитии млекопитающих и в различных патологических процессах. Функционирование bcl-2 требуется для поддержания жизнеспособности лимфоцитов, меланоцитов, эпителия кишечника и клеток почек во время развития эмбриона. bcl-x необходим для ингибирования смерти клеток в эмбриогенезе, особенно в нервной системе. Bax необходим для апоптоза тимоцитов и поддержания жизнеспособности сперматозоидов во время их развития. р53 является геном супрессии опухолей, поэтому в эмбриогенезе особой роли не играет, но обязательно необходим для супрессии опухолевого роста. Мыши, у которых отсутствовали оба р53 гена, проявляли чрезвычайно высокую склонность к развитию злокачественных опухолей в результате полного или частичного нарушения апоптоза предопухолевых клеток. Усиленный синтез белка, кодируемого bcl-2 геном, приводит к подавлению апоптоза и, соответственно, развитию опухолей; данный феномен обнаружен в клетках В-клеточной фолликулярной лимфомы. При лимфопролиферативных заболеваниях и похожей на системную красную волчанку болезни у мышей наблюдается нарушение функции Fas-лиганда или Fas-рецептора. Повышенный синтез Fas-лиганда может предупреждать отторжение трансплантата. Апоптоз является частью патологического процесса при инфицировании клетки аденовирусами, бакуловирусами, ВИЧ и вирусами гриппа. Ингибирование апоптоза наблюдается при персистировании инфекции, в латентном периоде, а при усиленной репликации аденовирусов, бакуловирусов, возможно герпесвирусов, вируса Эпштейн-Барра и ВИЧ наблюдается активация апоптоза, что способствует широкому распространению вируса. При нейродистрофических заболеваниях отмечается нарушение функции гена (iap-гена), сходного с ингибитором апоптоза бакуловирусов.

Апоптоз, некроз и пролиферация клеток. Благодаря проточной цитометрии исследователи могут легко отличать живые нейроны от тех, которые встали на путь клеточной смерти, и дифференцировать некротические нейроны от апоптозных на самых ранних стадиях. Апоптоз - генетически запрограммированная смерть, осуществляемая с помощью специфических механизмов и ферментов. При апоптозе клетка сморщивается, ее структуры разрушаются цистеиновыми-аспарагиновыми протеиназами, так называемыми каспазами. Семейство этих ферментов (в него входит около десяти различных протеиназ) составляет каскад взаимоконтролируемых белков, перевод которых в активное состояние требует одновременного присутствия ряда клеточных факторов. Такой ступенчатый механизм предохраняет от случайного возникновения апоптоза.

Некроз обусловлен механическим или иным повреждением клеточной мембраны, нарушением целостности и управляемости клетки. Клетки, не способные выполнять свои функции, умирают, а их большое количество создает в ткани очаг воспаления.

Несмотря на принципиальные отличия апоптоза и некроза, их объединяет полезное свойство - они помогают организму очиститься от ненужных (поврежденных) или вредных (чужеродных) структур. В очаг воспаления устремляются макрофаги и другие клетки, “мусорщики”, удаляющие некротические части тканей или чужеродные частицы (например, попавшие в ткани занозы). С помощью апоптоза организм пытается распознать и ликвидировать клетки-мутанты, ставшие опасными для организма (перерождающиеся спонтанно или под влиянием внешних факторов). Так, частота появления в организме злокачественных клеток много выше, чем вероятность самого заболевания, поскольку в большинстве случаев они распознаются и нейтрализуются иммунной системой без вреда для организма.

Апоптоз запрограммирован на постепенное контролируемое устранение клеток, а некроз осуществляется быстро, хаотически и неуправляемо. При апоптозе фрагменты клеток или даже целые белковые молекулы могут использоваться другими клетками для выполнения тех же самых функций. Например, в тимусе, где происходит созревание лимфоцитов, клетки, распадающиеся при апоптозе, поставляют свои белки-рецепторы для превращения “юных” лимфоцитов в полноценные иммунные клетки.

Эпителиальные клетки слизистой запрограммированы таким образом, что апоптоз индуцируется в них периодически и с большой частотой (они живут лишь 1,5-2 недели). Отторжение апоптозных клеток снижает вероятность проникновения в организм вирусной инфекции. Интересно, что в русской армии для предотвращения кишечных эпидемий по указу Петра I в пищу добавляли перец. Сегодня известно, что это прекрасное средство для активации апоптоза клеток слизистого эпителия.

Так или иначе, выгода распознавания ранних стадий и типа клеточной смерти очевидна. Для каждого из них имеются свои специфические маркеры. Один из фосфолипидов клеточных мембран, фосфатидилсерин, в нормальных условиях расположенный с внутренней стороны мембранного бислоя, при нарушениях цитоскелета сигнализирует о начале апоптоза. Кстати, именно так макрофаги распознают и удаляют злокачественные клетки. Белки, чувствительные к фосфатидилсерину (аннексины), используют для раннего распознавания апоптозных клеток. А для некротических клеток с поврежденной мембраной имеется другой маркер. Им может быть краситель, например иодид пропидия (PI), который связывается с нуклеиновыми кислотами, но не проникает через мембрану живых (нативных) клеток.

Экспериментально показано, что после длительной (30 мин) индукции окислительного стресса активацией NMDA-рецепторов появляются и некротические, и апоптозные клетки, причем их долю в популяции легко рассчитать. Таким образом, в руках исследователей имеется модель, позволяющая оценивать как потенциальную уязвимость нейронов со стороны различных факторов, так и возможность защиты клеток от апоптоза или некроза (например, с помощью лекарственных препаратов).

Следить за развитием апоптоза можно также, измеряя активность внутриклеточных каспаз, которые в клетке взаимно контролируют друг друга. Так, при связывании на клеточной мембране внеклеточных сигнальных молекул со специальным рецептором (CD95/Fas) в цитоплазме неактивная прокаспаза 8 превращается в активный фермент, который, в свою очередь, активирует каспазу 3, что открывает клетке путь к апоптозу. Нагружая клетки флуорогенным субстратом каспазы 3 и стимулируя их разными способами, можно измерять сигнал от флуоресцентного продукта. Растет продукт - активируется каспаза 3, и интенсивность сигнала будет пропорциональна активации фермента и вероятности развития апоптоза.

Однако каспаза 3 участвует не только в реализации апоптоза, но и во многих стадиях клеточного цикла и в процессах пролиферации. Особенно важны эти реакции для клеток иммунной системы. Значит, в ряде случаев активность каспазы 3 не обязательно означает начало апоптоза, а может быть связана с пролиферацией лимфоцитов.

Старение и апоптоз. Известный американский ученый Л.Хейфлик в Медицинском центре детской больницы Северной Каролины впервые доказал, что естественная продолжительность жизни человека обусловлена числом митозов, которое могут совершить клетки данного организма. Он брал кусочки кожи от эмбриона, новорожденного и взрослого человека, разбивал их на отдельные клетки и культивировал в специальной питательной среде. Оказалось, что клетки эмбриона могут совершить около 50 делений, а затем в них наблюдаются все признаки апоптотической смерти. У взрослого человека клетки могли совершить уже не 50, а гораздо меньше делений, в зависимости от возраста обследуемого пациента. Впоследствии было показано, что механизм старческого апоптоза запускается и находиться в ядре.

В настоящее время для объяснения молекулярно-генетических механизмов старения организма предложено три гипотезы.

1. Первая гипотеза особенно отчетливо развита в трудах профессора Ж. Медведева, а также Л. Орджелом из Института им. Солка в США. Эти исследователи считают, что старение это процесс накопления ошибок в процессах транскрипции и трансляции и возникновении ферментов с дефектным функционированием. При этом механизмы репарации не могут справится со все возрастающим количеством дефектов.

2. Согласно второй гипотезе, предложенной также Ж.Медведевым 0,4% информации содержащейся в ДНК клеточного ядра, используется клеткой постоянно на протяжении ее жизни. Кроме того, многие гены в молекуле ДНК повторяются, делая генетическую информацию в высокой степени избыточной. Ж. Медведев предположил, что повторяющиеся последовательности обычно репрессированы, но в случае значительного повреждения активного гена он заменяется одним из идентичных резервных генов. Избыточность ДНК может, следовательно, служить гарантией против внутренне присущей подверженности системы случайным молекулярным повреждениям. Однако постепенно весь резерв генов будет исчерпан и тогда начинают возникать патофизиологические изменения, которые приведут к гибели клетки. Таким образом, чем больше избыточной ДНК, тем больше продолжительность жизни данного вида.

3. Третья гипотеза постулирует, что возрастные изменения представляют собой продолжение нормальных генетических сигналов, регулирующих развитие животного от момента его зачатия до полового созревания. Быть может, есть «гены старения», которые замедляют или даже закрывают биохимические пути один за другим и ведут к предсказуемым возрастным изменениям. При этом снижаются функциональные возможности клеток. Старение организма - это по существу старение и апоптоз ключевых клеток, гибель которых способна повлиять на физиологию всего организма.

Фармакологическая коррекция апоптоза. Многочисленные исследования последних лет показали, что часто именно апоптоз, а не некроз лежит в основе инфаркта миокарда, острой почечной недостаточности, инсульта, травмы головного и спинного мозга и других заболеваний, связанных с высокой смертностью.

Известно несколько генов, ответственных за развитие апоптоза в спинном мозге: индукторы – Fas/apo-1, p53; ингибиторы - Bcl-2, bax. Хорошо изучены гены раннего немедленного ответа и соответствующие им белки. В частности, это белок р53, известный, как регулятор клеточного цикла и супрессор опухолей, который участвует в восстановлении ДНК - поврежденной клетки.

Как известно, апоптоз имеет две стадии: обратимую (начальная) и необратимую. Разработка терапевтического воздействия на апоптоз находится на начальном этапе. Знание временной характеристики развития апоптоза позволяет прогнозировать и планировать лечебную практику. Установлено, что метилпреднизолон подавляет апоптоз на отдалении очага травмы, рилузол – блокирует протеолиз цитоскелета.

Новую стратегию в разработке методов лечения поврежденного спинного мозга представляет подавление экспрессии проапоптозных генов (р53, bcl-x) с помощью антисмысловых олигодезоксинуклеотидов. Они ингибируют трансляцию мРНК.

Проблемными являются: нестойкость олигодезоксинуклеотидов; их доставка в клетку.

Другой подход к антиапоптозному лечению травмы спинного мозга – генная терапия.

В связи с апоптозом возникла необходимость пересмотра ряда концептуальных основ физиологии и патологии. Вместо прежних представлений о гибели многоклеточного организма, как отрицательном по значимости и часто случайном явлении, идентифицируемым с некрозом, сформировался новый взгляд, согласно которому гибель части клеток в пределах организма является закономерным и необходимым явлением, и само существование многоклеточного организма подразумевает баланс жизни и смерти на уровне составляющих его клеточных популяций.

Генетические механизмы канцерогенеза (нерегулируемый клеточный рост: клиническое значение).

Итак, мы определили молекулы, проводящие клетку по фазам клеточного цикла, включая G₁, G₁/S, S и S/G₂. Это сложно взаимодействующие молекулы, которые балансируют между фосфорилированным и дефосфорилированным состоянием, и таким образом сигнализируют о начале процесса. Конечно, для нормального течения клеточного цикла крайне важно присутствие субъединиц комплексов (Cdk-циклин) и различных ингибиторных белков.

В норме в течение эмбриогенеза и развития про­исходит быстрая пролиферация клеток. Мы знаем, что клетки могут терять свою способ­ность контролировать клеточный цикл, что приво­дит к нерегулируемому клеточному росту, то есть к раку.

Во всех тканях постоянно идут процессы физиологической регенерации, которая сопровождается делением и увеличением количества клеток. Нарушение этих процессов приводит к образованию опухоли. Они бывают доброкачественные и злокачественные. Тип развивающейся опухоли во многом зависит от природы поражённых генов.

Клетки злокачественной опухоли теряют дифференцировку, быстро размножаются и распространяются по организму, образуя вторичные опухоли. Кроме того, эти клетки выделяют продукты распада.

Доброкачественные опухоли не теряют дифференцировку, и не распространяются по организму (фиброма – опухоль соединительной ткани, миома – опухоль мышечной ткани, папиллома – опухоль кожи). Однако эти опухоли могут становиться злокачественными.

Под действием канцерогенов (излучения, химические вещества, онковирусы и др.) клетка становится злокачественной. Опухолевые клетки имеют изменённый геном, в котором мутации затрагивают не единичный ген, а целую совокупность генов.

Поэтому процесс опухолевого перерождения – не одномоментная мутация, а длительное накопление генетических дефектов. И лишь когда их сумма превышает критический предел, клетка превращается в опухолевую.

Всего в наших клетках — примерно по 25 000 генов. К онкогенезу же, во всех его возможных проявле­ниях, имеют отношение, по нынешним данным, не более 120-150 генов человека. Плюс некоторое количество вирусных генов. Все гены, которые могут отвечать за онкогенез, делят на несколько типов.

Во-первых, это так называемые мутаторные гены. При снижении их активности резко возрастает скорость накопления мутаций и других изменений генома. Очевидно, к данному типу относятся гены систем контроля за состоянием ДНК и репарации ее повреждений. При нарушении их действия развивается пигментная ксеродерма и опухоли кожи.

Во-вторых, это некоторые гены вирусного происхождения, т. е. вирусные онкогены.

Уже четко доказано, что целый ряд вирусов может вызы­вать (хотя, конечно, далеко не всегда вызывает) опухолевое пе­рерождение зараженной клетки.

Причем имеется одна общая для всех этих вирусов особен­ность: опухолевому перерождению клетки предшествует встраивание (интеграция) вирусных генов (в т. ч. и онкоге­нов) в одну из ее хромосом.

Однако интеграция вирусных он­когенов в клеточную хромосому вовсе не означает, что клетка немедленно превратится в опухолевую. Нередко вначале прохо­дит довольно продолжительный (до нескольких лет) латентный период. Более того, подчас перерождению подвергается даже не та клетка, которая была инфицирована, а одна из клеток сле­дующих поколений.

Все это и говорит о том, что одного лишь внедрения вирусных онкогенов в хромосомы хозяина недостаточно для трансформа­ции клетки. Требуется еще серия каких-то (видимо, случайных, но достаточно определенных) изменений клеточного генома. Известно более 50 ретровирусов, вызывающих онкогенез.

В-третьих, это протоонкогены. Так называются вполне нор­мальные гены клетки (мало того, необходимые ей для обеспече­ния ряда ключевых процессов), которые, однако, становятся крайне опасными при неконтролируемой экспрессии или модификации функций.

Таким образом, изменение структуры самих этих генов или каких-то других генов, контролирующих их активность, превращает протоонкогены в настоящие клеточные онкогены. Иногда этому превращению могут способствовать и вирусные онкогены. К протоонкогенам относится ген циклина Д. Его гиперэкспрессия (амплификация) вызывает рак молочных и слюнных желез.

В-четвертых, это т.н. опухолевые супрессоры. Здесь ситуация об­ратная: потенциально опасно (в плане онкогенеза) не бескон­трольное усиление функции такого гена, а наоборот — выклю­чение функции. Что опять-таки происходит вследствие той или иной генетической перестройки либо мутации. К опухолевым супрессорам относится ген р53.

В конце 60-х годов XX века при гибридизации злокачественных клеток с нормальными была вы­явлена супрессия (подавление) злокачественных свойств клетки. Возврат клетки к неограниченному размножению происходил после потери определённой хромосомы. Это позволило сформулировать понятие о наличии в геноме осо­бой группы генов, названных антионкогенами, или генами-супрессорами опу­холей. Это аутосомно-доминантные гены.

Функция антионкогенов — подавлять пролиферацию клеток, если она воз­никнет в несоответствующем месте и в несоответствующее время. Если в обо­их локусах (материнского и отцовского происхождения) антионкоген будет мутантным или делетированным, то начинается неконтролируемая пролифе­рация клеток. Вначале цитогенетическими, а позже молекулярно-генетическими исследованиями установлены следующие закономерности действия генов-супрессоров опухолей.

Индивид наследует от одного из родителей мутацию в локусе гена-супрессора. Это может быть один из вариантов генной мутации или микроделеция. Гетерозиготность индивида по данному локусу страхует его от возникновения опухоли, поскольку ген-супрессор — доминантный ген. Однако в процессе жизни в соматических клетках идёт мутационный процесс, в том числе могут возникнуть мутации в «здоровой» хромосоме. Клетка будет гомозиготна, и, следовательно, снимается супрессия онкогенности. Это явление называется потерей конституциональной (врождён­ной) гетерозиготности. У человека уже описано много синдромов, при которых потеря гетерозиготности ведёт к злока­чественным новообразованиям. Для многих из этих форм известна не только хромо­сомная локализация гена, но и его структура, мутации и первичные продукты действия генов. Однако для возникновения одной и той же опухоли необходима потеря гетерозиготности не в одном, а в нескольких локусах. Кроме того, нужны ещё мутации в онкогенах. Многокомпонентность генетических событий очевидна.

Заметим: мутаторные гены (т. е. гены систем контроля за состоянием ДНК и репарации ее повреждений) формально под­падают под определение опухолевых супрессоров. При их вы­ключении риск трансформации клетки резко возрастает.

И все-таки целесообразно выделять мутаторные гены среди опухолевых супрессоров в силу их особой функциональной ро­ли. Хотя, повторяем, это выделение подчас является достаточно условным.

Всего известно около 100 протоонкогенов и порядка 20 опухолевых супрессоров. Это гены белков, участвующих (в качестве «приводных ремней» или сдерживающих факторов) в таких процессах, как репарация ДНК, клеточный цикл, апоптоз и дифференцировка клеток. Потому-то все эти процессы завязаны с онкогенезом в единый узел (рис. 48).

Рис.48. Нарушение регуляции клеточного цикла и развитие рака

Канцерогенные факторы. В 2000 году в мире, по данным Международного агентства по исследованию рака (МАИР) (Лион), было зарегистрировано более 10 млн. случаев заболевания злокачественными опухолями (ЗО), а в 2020 году число вновь выявленных случаев ЗО достигнет 16 млн. Рост количества заболевших ЗО в мире происходит как в результате увеличения численности населения, так и его старения. Причиной увеличения числа заболевших ЗО является также распространение в мире и, особенно в развивающихся странах факторов окружающей среды и образа жизни, которые являются причиной рака. В то же время в большинстве развитых стран снижаются стандартизованная по возрасту заболеваемость и смертность на 100 тыс. населения от многих форм ЗО. Снижение заболеваемости ЗО, как известно, достигается в первую очередь первичной профилактикой. Снижение же смертности происходит в результате уменьшения заболеваемости, а также улучшения выживаемости, что в свою очередь может быть результатом усовершенствования методов диагностики и лечения.

Принято считать, что примерно в 90% случаев возникновение рака обусловлено воздействием канцерогенных веществ в окружающей среде. Канцерогены обнаруживают не только вблизи мест их выбросов, но и далеко за их пределами. Повсеместное их присутствие показывает, что изолировать человека от них практически невозможно: загрязнение среды носит глобальный характер.

Канцерогены — химические, физические и биологические агенты природного и антропогенного происхождения — способны при определенных условиях индуцировать рак у животных и человека.

Физические факторы. К физическим канцерогенным факторам относятся: корпускулярные (а- и β-) излучения, ионизирующие излучения (рентгеновские и γ-лучи), не ионизирующие ультрафиолетовые лучи и, наконец, химически инертные вещества (или считающиеся таковыми).

Ионизирующее излучение — один из самых известных экзогенных факторов канцерогенеза. Оно вызывает появление опухоли, причину которой легко связать с его воздействием, например, когда опухоль появляется в облученной анатомической зоне. Частота таких злокачественных опухолей возрастает по мере повышения дозы облучения и не уменьшается при защите других участков тела. Наиболее яркий пример — опухоли кожи, встречающиеся у рентгенологов. Умеренное, но продолжительное суммарное облучение, которому подвергался человек, может быть причиной различных видов лейкозов. Известна относительно высокая частота их среди рентгенологов, а также жителей Нагасаки и Хиросимы, переживших атомную бомбардировку, у больных, лечившихся облучением позвоночника по поводу ревматизма, у детей, облучен­ных в утробе матери при рентгенографии таза. При исследовании случаев злокачественных заболеваний, вызванных пренатальным облучением, выявилась линейная зависимость между дозой и частотой возникновения опухолей. Остается спорным вопрос о существовании пороговой дозы облучения, ниже которой не проявляется канцерогенное действие.

Ультрафиолетовые лучи имеют свои особенности. Они не обладают ионизирующими свойствами и проникают в ткани организма не глубже чем на 2 мм (их проникающая способность ниже проникающей способности ионизирующего излучения, поскольку длина их волны значительно больше). Не удивительно, что чаще всего они вызывают рак кожи. Соответствующий комитет Национальной академии наук США установил роль воздействия ультрафиолетового солнечного излучения в 80% случаев карцином и 40% случаев меланом кожи. В эксперименте удавалось вызывать опухоли в месте имплантации различных веществ.

Химические факторы. Свыше 1000 химических веществ, которые человек поглощает с едой, питьем, вдыхает и в которых он купается, могут быть потенциальными канцерогенами. Они принадлежат ко всем химическим классам. Первыми были изучены полициклические углеводороды, после того как в 1775 г. выяснилась роль сажи (а значит, и каменноугольной смолы, которую она содержит) в возникновении рака мошонки у трубочистов.

140 лет спустя японские ученые Ямагива и Ишикава вызвали у кроликов рак кожи при смазывании ее каменноугольной смолой. У животных, как и у человека, опухоли появляются только через месяцы и годы после контакта с канцерогенным веществом (так называемый латентный период). Выяснилось, что смола, получаемая из угля, нагретого до 1200° С, не канцерогенна, а из угля, нагретого только до 800° С,— сильный канцероген. Перегонка смолы при различных температурах позволила выявить канцерогенность различных ее фракций. Так была выявлена причастность к канцерогенезу некоторых углеводородов и выделен из каменноугольной смолы один из них — 3,4-бензпирен. Другие углеводороды были синтезированы или выделены из смол, полученных с помощью синтеза. Составной частью канцерогенных углеводородов является антрацен, химическая формула которого имеет в своем составе три бензольных кольца. Дибензантрацен, как следует из его названия,— производный бензантрацена, один из сильнейших канцерогенных углеводородов. Существует целый ряд канцерогенных углеводородов, признанных сегодня опасными для человека, используемых в промышленности и быту, в онкологических лабораториях для воспроизводства разнообразных экспериментальных опухолей. Чаще всего в лаборатории используется метилхолантрен.

В эксперименте в качестве канцерогенов прибегают к некоторым производным хлора: четыреххлористому углероду, хлороформу, гептахлору, различным пестицидам (ДДТ и диальдрин). Известно, что хлорвинил — мономер, используемый для производства пластмасс, являющихся его полимером,— может вызвать рак печени у человека и крыс. Особенно опасны некоторые производные азота; лучше всего изучены амины. С конца прошлого века известно, что производные ароматического амина — анилина — вызывают рак мочевых путей, в частности мочевого пузыря; в этом отношении наибольшую опасность представляет нафтиламин. Другое производное анилина — фенацетин, обезболивающий искусственный препарат — изучается как вероят­ный канцероген. Имеются отдельные наблюдения за онкологическими больными, которые широко пользовались фенацетином задолго до появления у них опухолей.

Совсем недавно установлено, что в желудке крысы происходит абсорбция нитритов и некоторых азотистых соединений (аминов и амидов), которые, вступая в химическую реакцию, образуют нитрозамины — сильные канцерогены. Установлена также канцерогенность синтетических органических соединений (используемых в качестве противоопухолевых препаратов) и половых гормонов. Среди канцерогенов оказался уретан, которым перестали пользоваться в лечебных целях, но все еще пользуются в лабораториях.

Известны канцерогенные свойства органических веществ растительного происхождения (дубильных веществ и некоторых алкалоидов), лекарств (как подозревает Армстронг, резерпин способствует заболеванию раком молочной железы у женщин), веществ, выделяемых грибами (афлатоксин — продукт плесени земляного ореха и др.), соединений, образуемых бактериями (этионина, выделяемого кишечной палочкой) и др. Даже среди минеральных веществ есть канцерогены: асбест (на первом месте), хром, никель, кадмий, свинец, олово, железо, мышьяк...

Комбинированные канцерогены. Канцерогены могут состоять из активного вещества с доказанной или предполагаемой канцерогенностью или нести в организм иные вещества, представляющие собой вероятные канцерогены. При этом образуются канцерогенные смеси и комбинации.

Роль табака в появлении некоторых опухолей человека полностью доказана многочисленными эпидемиологическими исследованиями, проведенными почти во всех странах. Чаще всего у курильщиков возникает рак легкого. Риск появления этого рака четко коррелируется с количеством выкуриваемых сигарет.

Известно множество типов рака, возникновение которых может быть связано с курением табака. Они встречаются с различной частотой. В качестве примера комплексных канцерогенов могут рассматриваться алкогольные напитки, так как они не употребляются в виде чистого этилового спирта, а содержат в себе продукты перегонки и добавки, среди которых имеются полициклические углеводороды, нитрозамины, афлатоксины и т. д. Кроме того, спирт — превосходный растворитель некоторых из этих веществ, а его роль в воспалении слизистой оболочки верхних отделов пищеварительного тракта очевидна. Опухоли, вызываемые алкоголем, чуть меньше распространены, чем вызываемые табаком, но разновидностей их больше. Вероятность обнаружения рака у алкоголиков (по сравнению с непьющими) в пять с лишним раз больше для опухолей рта, в 10 раз больше для опухолей гортани и в 17 раз — пищевода. Повышение канцерогенного риска, вызываемого алкоголем, хорошо доказано для рака молочной и щитовидной желез, меланом кожи. Как подозревают, алкоголь влияет на частоту возникновения рака желудка, поджелудочной и предстательной желез. Доказано, что у любителей пива повышенный риск рака прямой кишки. Только совсем недавно некоторые эпидемиологи на основе достоверных данных обвинили кофе в причастности к появлению рака ряда локализаций, в частности мочевого пузыря.

На возникновение опухолей комплексное воздействие оказывают продукты питания, в которых трудно выделить относительное влияние различных качественных и количественных факторов. Доказана связь высокой частоты рака, в частности опухолей, не связанных с пищеварительной системой, с ожирением. Установлена четкая корреляция между высококалорийной пищей и частотой рака молочной железы у женщин. Ярким проявлением данной закономерности может служить очень высокая частота рака этой локализации у американок и очень низкая у японок по сравнению со средним мировым уровнем. Крысы, которым скармливали малокалорийный корм, в три раза реже поражались раком, чем крысы, находившиеся на обильном рационе. Излишек белков в корме повышает у крыс частоту опухолей, вызываемых химическими канцерогенами, а скудный, рацион уменьшает у них частоту опухолей, вызываемых нитрозаминами. Влияние такого рациона может быть частично косвенным: содержащиеся в нем белки изменяют активность ферментов печени, способные превращать в канцерогены вещества, которые таковыми не являются, и наборот.

Некоторые составные части белков (отдельные аминокислоты) выполняют особую роль: так, добавка триптофана в пищу повышает частоту рака печени, вызываемого нитрозамином.

Биологические факторы. Живые организмы, а именно некоторые гельминты, бактерии и вирусы, могут играть ведущую роль в появлении рака. Шистосомы — наиболее драматический пример гельминта, способствующего развитию злокачественных новообразований. Они вызывают различные повреждения внутренних органов в зависимости от вида паразита. В частности, в Египте наблюдается шистосомный цистит, который очень часто осложняется раком мочевого пузыря. И действительно, это наиболее частый вид злокачественной опухоли среди населения данной страны: от шистосоматоза и вызываемого им рака зависит пока еще не высокий (50 лет) прогноз жизни египтян. Говоря об этом, мы имеем в виду тот факт, что воспаление проявляет себя как предшественник рака. Воспаление мочевого пузыря не единственный случай хронического воспаления, способствующего раку. В принципе важно выявить связь между количеством и соотношением различных бактерий в организме или в некоторых его анатомических отделах, с одной стороны, и частотой рака различных локализаций, с другой. Факты свидетельствуют в пользу возможного влияния состояния кишечной флоры на возникновение рака не только толстой кишки, но и молочной железы. Отмечена также связь между инфекцией мочевых путей и заболеваемостью раком – желудка. В первом случае допускают, что кишечные бактерии вырабатывают канцерогены из пищевых веществ и составных частей желчи, во втором случае возможно участие микробов в превращении нитратов в нитрозамины.

Экологические наблюдения послужили основой для изучения радиационного и химического канцерогенеза задолго до рождения онкоэпидемиологии как медицинской дисциплины. Теперь, через 75 лет после того, как Боррелем была высказана вирусная теория канцерогенеза и прошло свыше 10 лет с момента активного ее развития, эпидемиологи все еще ищут доказательства участия вирусов в канцерогенезе. Но уже сегодня можно утверждать, что некоторые вирусы, выделенные от животного или человека, являются сильными канцерогенами для животных, у которых они обнаружены. Вирусы играют основную роль в спонтанном канцерогенезе этих и других видов животных. Разумно предположить, что вирусы играют не менее важную роль в канцерогенезе у человека. Пока же достаточно достоверные данные о вирусном канцерогенезе касаются только экспериментов. Опережение экспериментальными исследованиями клинических в этой области весьма значительно: открытие первого известного канцерогенного вируса, вируса лейкоза кур, произошло в начале текущего столетия. Одни вирусы вызывают появление спонтанных опухолей, в большинстве случаев злокачественных, другие — доброкачественных опухолей (фибром и папиллом). Одни опухоли образуются у животных, не подвергнутых отбору по генетическим признакам, другие главным образом у животных чистых линий (рак молочной железы и лейкозы у мышей). Действие вирусов было раскрыто воздействием ультрафильтрата опухолевой ткани на здоровых животных. Опухоли появляются только после более или менее продолжительного латентного периода. В некоторых случаях канцерогенный эффект не зависит от возраста реципиента. В других же, в частности при спонтанном лейкозе мышей, развитие злокачественного заболевания происходит только при заражении тотчас после рождения особи. Это экспериментальное наблюдение позволило предположить, что существуют два типа передачи канцерогенных вирусов: горизонтальная, осуществляемая различными носителями и действующая независимо от возраста реципиента, и вертикальная, осуществляемая только у новорожденных или плода; ее носители сперма, яйцеклетка и молоко.

Как известно, существуют ДНК- и РНК – вирусы. ДНК-вирусы способны либо разрушить, либо изменить клетки, которые они инфицируют. Как правило, в измененных клетках деление вируса прекращается (т. е. эти клетки не производят инфекционных вирусов), а наличие вирусной информации выражается только появлением новых антигенов (кодируемых вирусным геномом). Различные канцерогенные ДНК-вирусы существенно отличаются друг от друга морфологическими признаками.

РНК-вирусы ведут себя по-разному: они не разрушают клетку; некоторые из них трансформируют ее. Цикл размножения вируса может продолжаться непрерывно и независимо от клеточного деления и заканчиваться образованием новых вирусных частиц. Канцерогенность вируса РНК обычно довольно слабая. Она ярче проявляется при индукции сарком и слабее — при развитии лейкоза. Среди ДНК- и РНК-вирусов есть и такие, которые не могут заканчивать цикл своего развития образованием полных вирусных частиц. Их называют дефектными. Некоторые РНК-вирусы, в частности вызывающие саркому, нуждаются во вспомогательном вирусе, называемом «хелпер», а именно вирусе лейкоза, который обеспечивает вирус саркомы рядом молекул для построения мембраны.

Среди ДНК-вирусов, выделенных от человека, «кандидат номер один» в группу вирусов, имеющих этиологическое значение в канцерогенезе, вирус Эпштейна — Барр (ЭБВ), который принадлежит к семейству вирусов герпеса. Если предположить, что ЭБВ является канцерогенным для человека, факт его повсеместного распространения свидетельствует о том, что для возникновения опухоли под влиянием этого вируса требуются дополнительные условия. В Африке географическое совпадение зон малярии и лимфомы Беркитта позволило предположить, что дополнительным фактором является малярия.

Среди других ДНК-вирусов, выделенных от человека, заслуживают рассмотрения три группы: аденовирусы; вирусы, вызывающие бородавки, и вирус гепатита В, или «австралийский антиген». Известно, что аденовирусы человека вызывают рак у хомяков, но поиски самих вирусов или антител против них, проведенные у онкологических больных, не увенчались успехом. Есть вирусы, известные тем, что они вызывают появление бородавок, но нет данных, позволяющих с уверенностью говорить о том, что они вызывают рак у людей. Наконец, вирус гепатита В был заподозрен в том, что он вызывает рак печени только у жителей Африки (где его антиген чаще выявляется у больных раком печени). Подозревают также, что вирус вызывает и лейкоз (как полагают, лейкоз связан с устойчивостью вируса, передаваемого чаще всего при переливании крови). Здесь необходимо напомнить, что вирусный гепатит может осложняться болезнью костного мозга — аплазией, т.е. исчезновением клеток — продуцентов крови; эта болезнь сама по себе иногда осложняется лейкозом.

Некоторые РНК-вирусы, выделенные от человека, обратили на себя внимание эпидемиологов и биологов. Их интересует, например, вопрос: не повышает ли вирус гриппа, когда он инфицирует плод в утробе матери, риск, что дети заболеют лейкозом? Особенно настойчиво исследуются канцерогенные РНК-вирусы при опухолях человека, соответствующих трем типам злокачественных заболеваний, вызываемых вирусами у мышей и других животных: лейкозу, саркомам и раку молочной железы.

Рассмотренные выше элементы (протоонкогены, клеточные он­когены, антионкогены, потеря гетерозиготности по генам-супрессорам, ассо­циации с генетическими маркёрами) и факторы канцерогенеза не исчерпывают всей многокомпонентности генетического предрасположения к раку и многофакторности причин опу­холевого процесса. Можно определить, по меньшей мере ещё две группы наследственных характеристик индивида, имеющих отношение к канцерогенезу

Во-первых, процессы репарации ДНК. В поддержании генетического гомеостаза ДНК и стабильности генетических структур клетки, а именно они опре­деляют нормальное поведение клетки, существенную роль играют репаративные процессы. Организм человека располагает уникальными возможностями репарации возникающих спонтанно или под влиянием внешних факторов повреждений ДНК, ведущих к мутациям (темновая, эксцизионная репарация, внеплановый синтез ДНК). Наследственные аномалии в системах репарации ДНК ведут к злокачественным новообразованиям (пигментная ксеродерма, наследственный неполипозный колоректальный рак, атаксия-телеангиэктазия и др.).

Во-вторых, метаболизм канцерогенов в организме определяется биохими­ческими системами, многие из которых представлены генетически полиморф­ными формами. Полиморфизм активирующих ксенобиотики ферментов (эстеразы, оксигеназы, изоформа цитохрома Р450) и детоксицирующих фермен­тов (различные трансферазы) определяет индивидуальную чувствительность к канцерогенным воздействиям.

Таким образом, медико-генетическое консультирование семьи с наследствен­ной предрасположенностью к злокачественным новообразованиям — слож­нейшая задача. Требуются специальная подготовка врачей- генетиков в вопро­сах генетических основ канцерогенеза и хорошая лабораторная база. Только такое сочетание позволит правильно выявить предрасположенность членов семьи, определить необходимость их диспансерного наблюдения и характер профилактических мероприятий.