Л/р8. Освоение техники приготовления мазка крови, его фиксации и окраски. Подсчет лейкоцитарной формулы и лейкоцитарного профиля.

Цель

Овладеть техникой наненсения, окрашивания и фиксации мазка крови. Освоить метод подсчета лейкоцитарной формулы и лейкоцитарного профиля.

Приборы и материалы

1. Пластиковые пеналы для обездвиживания крыс, скарификаторы, ножницы, вата, спирт этиловый 96%, йод, моток ниток, фильтровальная бумага.

2. Микроскопы, иммерсионное масло, предметные и шлифовальные стекла, электроплитка, мерные пипетки, посуда для фиксации, штатив для сушки мазков на воздухе, пинцет, смесь Никифорова, фиксаж для мазков, рабочие растворы азура и эозина, клавишные счетчики. Объект исследования: белая лабораторная крыса или человек.

Ход работы.

Мазки крови делают на предметных стеклах с помощью более узкого шлифованного предметного стекла.

1. Подготовка стекол. С предметных стекол, бывших в употреблении, сухой ветошью или бензином удаляют иммерсионное масло и кипятят их без мыла и соды в течение 15-20 мин, промывают чистой водой и погружают на 1 ч в насыщенный раствор двухромовокислого калия в серной кислоте. При отсутствии двухромовокислого калия и серной кислоты стекла кладут в мыльный раствор и выдерживают в нем 8-10 ч, а затем в том же растворе кипятят их 5-10 мин (от более длительного кипячения стекла мутнеют). Обработанные таким образом стекла промывают в течение 1 ч под струей водопроводной воды и насухо вытирают чистым полотенцем. Стекла, не бывшие в употреблении, промывают в горячей воде и насухо вытирают. Хранят стекла в стеклянной широкогорлой банке с притертой крышкой в смеси Никифорова (спирт и эфир 1:1). Перед употреблением стекла достают пинцетом и насухо вытирают полотняной или шелковой тряпочкой.

2. Приготовление мазка. Взяв предметное стекло за длинные края, прикасаются его поверхностью (отступая 0,5-1 см от края) к верхушке выступившей капли крови. Правой рукой приставляют шлифованное стекло к краю капли и наклоняют его на 45°, чтобы кровь растеклась по углу, образованному двумя стеклами. Затем легким быстрым движением кровь "тянут" по стеклу, пока не будет исчерпана вся капля. Если не "толкать" каплю, не надавливать на стекло и не останавливаться, то мазок закончиться "метелочкой" за 1-1,5 см до края стекла, будет тонким и желтоватым. После приготовления мазки быстро сушат на воздухе до исчезновения влажного блеска. При медленном высыхании может изменяться морфология клеток.

3. Фиксация. Мазки фиксируют, погружая в стаканчик с фиксажем: 3 г сернокислого цинка, 1 г хлористого натрия, 100 мл воды. на 1 мин. Можно обрабатывать сразу несколько стекол, сложенных попарно мазками наружу. После фиксации мазки устанавливают вертикально на лист фильтровальной бумаги около плитки (t = 37°).

4 . Окраска обычно производится по Романовскому-Гимзе. Предварительно приготовленные растворы азура (1 г азура + 1 л воды) и эозина (1 г эозина + 1 л воды). Через сутки непосредственно перед окрашиванием смешивают раствор азура с раствором эозина и водой (в пропорции 2:1:2) и в эту смесь погружают мазки на 30-40 минут. Смывают краситель проточной водой и высушивают на воздухе.

5. Подсчет лейкоцитов проводят при иммерсионной микроскопии. Лейкоциты в зависимости от плотности распределяются в мазках неравномерно: нейтрофилы, базофилы, эозинофилы – по периферии, ближе к краям; моноциты, лимфоциты – ближе к середине, поэтому при подсчете стараются охватить разные участки мазка, передвигая поле зрения "змейкой". По Шиллингу определяют кол-во лейкоцитов в четырех участках мазка (четырехпольный метод). По Филиппченко мазок мысленно делят на 3 части: начальную, среднюю и конечную (трехпольный метод). В каждой части подсчитывают одинаковое кол-во клеток.

При дифференциации лейкоцитов следует помнить основные особенности отдельных типов. Для гранулоцитов наиболее характерной морфологической особенностью является отчетливо выраженная зернистость цитоплазмы: обильная пылевидная розовато-фиолетовая – у нейтрофилов; крупная, занимающая всю цитоплазму, алая ("кетовая икра") – у зрелых эозинофилов; крупная, неоднородная, темно-фиолетовая или черная – у базофилов. Молодые незрелые гранулоциты (миелобласт, промиелоцит, нейтрофильный, эозинофильный и базофильный миелоциты и метамиелоциты) крупнее, их ядро светлее, по форме – округлое или слегка вогнутое, нередко содержит нуклеолы. Зрелые гранулоциты (палочкоядерные и сегментоядерные) — меньших размеров, их ядра более темного цвета, имеют вид изогнутых палочек или отдельных сегментов, соединенных “ниточкой” ядерного вещества. Ядра не содержат нуклеол. У клеток моноцитарного ростка в бледно-голубой или сероватой цитоплазме отсутствует выраженная зернистость, но иногда можно обнаружить отдельные мелкие азурофильные гранулы, вакуоли. У незрелых клеток моноцитарного ряда (монобласта, промоноцита) ядро крупное, занимает большую часть клетки. Ядро зрелого моноцита меньших размеров и имеет вид бабочки или гриба, хотя нередко может принимать другие причудливые формы. Для клеток лимфатического ростка (лимфобласта, пролимфоцита и лимфоцита) характерно очень большое округлое, иногда бобовидное ядро плотной структуры, занимающее почти всю клетку. Цитоплазма синего или голубого цвета расположена узкой полоской вокруг ядра и лишена специфической зернистости, в связи с чем лимфоциты вместе с моноцитами получили название агранулоцитов.

Большое диагностическое значение имеет выявление дегенеративных форм лейкоцитов. Наиболее распространенные из них: 1. Нейтрофилы с токсогенной зернистостью и вакуолизацией цитоплазмы. Токсическая зернистость нейтрофилов возникает в результате коагуляции белка цитоплазмы под влиянием инфекционного или токсического агента. В этих случаях, помимо типичных, появляются крупные грубые базофильные гранулы и вакуоли. 2. Гиперсегментированные нейтрофилы, ядро которых состоит из 6 и более сегментов, встречаются при В12-фолиеводефицитной анемии, лейкозах, а также при некоторых инфекциях и гнойно-воспалительных заболеваниях, отражая так называемый ядерный сдвиг нейтрофилов вправо (см. ниже). 3. Дегенеративные изменения лимфоцитов в виде пикнотически измененного ядра, иногда имеющего двудольчатое строение, и слабого развития или отсутствия цитоплазмы. 4. Тени Боткина-Гумпрехта – это остатки поврежденных лимфоцитов в виде скоплений светлых хроматиновых тяжей. Голые лимфоцитарные ядра, а также тени Боткина-Гумпрехта встречаются при хроническом лимфолейкозе. 5. Атипичные мононуклеары (лимфомоноциты), сочетающие в себе признаки лимфоцитов (меньше моноцитов) и моноцитов (крупнее лимфоцитов, содержат моноцитарное ядро). Встречаются при инфекционном мононуклеозе.

Во всех случаях подсчитывают не менее 100 лейкоцитов. Если обнаруживаются отклонения от нормы, просматривают еще 100. Обнаруженные клетки записывают в спец. таблицу дифференциального подсчета. На основе этих данных рассчитывают лейкоцитарную формулу (ФЛ) и лейкоцитарный профиль (ПЛ).

Таблица подсчета лейкоцитов
Пока-затель	Всего	Б	Э	Н		Л	М
				П	С
Счет	100
ФЛ	100%
ПЛ

6. Лейкоцитарная формула (дифференцированный подсчет лейкоцитов, лейкоцитограмма, Differential White Blood Cell Count) – содержание лейкоцитов разных типов в % от общего кол-ва. Следует учитывать, что изменение процентного содержания отдельных видов лейкоцитов не всегда соответствует их истинному увеличению или уменьшению. Например, при нейтропении может обнаруживаться относительное увеличение процента лимфоцитов и моноцитов, тогда как их абсолютное количество будет в норме. Поэтому для правильной интерпретации изменений ФЛ необходимо оценить не только процентные соотношения, но и абсолютное содержание различных видов лейкоцитов в 1 л крови. Для этого подсчитывают кол-во лейкоцитов в мм³, используя руководство к л/р 6.

7 . Лейкоцитарный профиль – графическое изображение абсолютного кол-ва отдельных видов лейкоцитов в 1 мм³ крови. Может быть рассчитан, если известно кол-во лейкоцитов / мм³ и лейкоцитарная формула. Для построения ПЛ пользуются сеткой Ш.Д. Мошковского в модификации Г.В. Домрачева и Н.3. Обжорина. По горизонтали обозначают виды лейкоцитов, по вертикали – их кол-вo. Заштриховаными прямоугольниками обозначают границы нормы.

Таблица 2. Лейкоцитарная формула и лейкоцитарный профиль
Пока-затель	Объект иссл.	Б	Э	Н		Л	М
				П	С
ФЛ	Чел.	0-1%	2-4%	3-5%	50-70%	25-40%	2-8%
	Крыса	0-0,5%	1-5%	1-4%	20-35%	55-75%	1-5%
ПЛ	Чел.	0-80	100-250	3000-6000		1200-2800	200-600
	Крыса	0-20	80-450	1600-2800		4400-600	80-450

Для определения процентного соотношения незрелых и зрелых форм нейтрофилов рассчитывают ядерный индекс сдвига нейтрофилов = n палочкоядерных нейтрофилов / n сегментоядерных нейтрофилов. В норме ядерный индекс сдвига равен 0,05-0,1.

Рекомендации к оформлению.

Коротко записываю название, цель и ход работы. Приводят таблицу с кол-вом лейкоцитов разных типов, замеченных в мазке, ФЛ, ПЛ. Сравнивают значения с нормой, приведенной в табл. 2. При отклонении от нормы приводят его возможные причины. Наиболее распространенными изменениями лейкоцитарной формулы являются:

1. Сдвиг лейкоцитарной формулы влево – увеличение количества незрелых (палочкоядерных) нейтрофилов. Сдвиг лейкоцитарной формулы вправо – увеличение числа сегментоядерных нейтрофилов с гиперсегментированными ядрами (некоторые типы анемий, болезни почек и печени, состояние после переливания крови). Еще более молодые клетки нейтрофильного ряда – юные (метамиелоциты), миелоциты, промиелоциты – появляются в периферической крови только в случае патологии.

2. Нейтрофилез (количество нейтрофилов больше 6×10⁹/л): развивается а) при острых инфекциях (бактериальных, паразитарных, грибковых и риккетсиозных); б) при острых и гнойных воспалениях или некрозе тканей (инфаркт миокарда, инсульт, обширные ожоги, гангрена, острый ревматизм, ревматоидный артрит, панкреатит, дерматит, перитонит); в) при интоксикациях или отравлениях (диабетический ацидоз, отравления свинцом, бензолом, вакцинации); г) при приеме кортикостероидов, гистамина, гепарина; д) при острых кровотечениях и гемолитических кризах, после оперативного вмешательства; е) при миелопролиферативных заболеваниях (хронический миелолейкоз, эритремия); ж) физиологический нейтрофилез при стрессовых ситуациях, физическом напряжении и эмоциональных нагрузках (может привести к удвоению количества нейтрофилов в периферической крови).

  4. Нейтропения развивается при бактериальных инфекциях (тиф, бактериальный эндокардит, туберкулез), вирусных инфекциях (инфекционный гепатит, грипп, корь, ветряная оспа), малярии, хронических воспалительных заболеваниях (особенно у пожилых и ослабленных людей), почечной недостаточности, тяжелых формах сепсиса, аутоиммунных заболеваниях, анафилактическом шоке, наследственных формах нейтропении, приеме противоопухолевых препаратов (цитостатики и иммунодепрессанты);

5. Эозинофилия встречается при аллергических заболеваниях, паразитарных инвазиях, гемобластозах и других опухолях, особенно с метастазами или некрозами, болезнях соединительной ткани (ревматоидный артрит), заболеваниях легких, некоторых детских инфекциях (скарлатина, ветряная оспа). Ээозинофилия соответствует началу выздоровления. Однако ряд инфекционных заболеваний с высоким уровнем IgE характеризуются высоким числом эозинофилов в крови после окончания воспалительного процесса, что указывает на незаконченность иммунной реакции с её аллергическим компонентом.

6. Эозинопения наблюдается в начале воспаления, при повышении адренокортикоидной активности, при гнойно-септических процессах. Снижение числа эозинофилов в активной фазе заболевания или в послеоперационном периоде часто свидетельствует о тяжелом состоянии.

7. Базофилия. Ее причинами могут быть аллергические реакции на пищу, лекарства, введение чужеродного белка; хронический миелолейкоз, эритремия; гипотиреоз, нефрит, хронический язвенный колит, гемолитические анемии, В₁₂-дефицитная анемия, спленэктомия, лечение эстрогенами, сахарный диабет, острый гепатит с желтухой.

8. Моноцитоз развивается при вирусных, грибковых, протозойных инфекциях, при выздоровлении после острых инфекций, коллагенозах (системная красная волчанка, ревматоидный артрит, узелковый периартериит), болезнях крови.

9. Моноцитопения развивается при нарушениях кроветворения, оперативных вмешательствах и шоковых состояниях.

10. Лимфоцитоз встречается при вирусных инфекциях (острый вирусный гепатит, коклюш, ОРВИ, герпес), при заболеваниях лимфатической системы, туберкулезе, интоксикациях (свинец, мышьяк).

11. Лимфоцитопения развивается в начальной стадии инфекционно-токсического процесса, при тяжелых вирусных заболеваниях, приеме кортикостероидов, злокачественных новообразованиях, вторичных иммунных дефицитах, почечнаой недостаточности, недостаточности кровообращения, приеме препаратов с цитостатическим действием. Следует иметь в виду, что лейкоцитарная формула отражает относительное (процентное) содержание лейкоцитов различных видов, и увеличение или снижение процентного содержания лимфоцитов может не отражать истинный (абсолютный) лимфоцитоз или лимфопению, а быть следствием снижения или повышения абсолютного числа лейкоцитов других видов (обычно нейтрофилов).