Темновая стадия

В темновой стадии с участием АТФ и НАДФН происходит восстановление CO2 до глюкозы (C6H12O6). Хотя свет не требуется для осуществления данного процесса, он участвует в его регуляции.

С3-фотосинтез, цикл Кальвина

Цикл Кальвина или восстановительный пентозофосфатный цикл состоит из трёх стадий:

• Карбоксилирования

• Восстановления

• Регенерация акцептора CO2

На первой стадии к рибулозо-1,5-бифосфату присоединяется CO2 под действием фермента рибулозобисфосфат-карбоксилаза/оксигеназа (Rubisco). Этот белок составляет основную фракцию белков хлоропласта и предположительно наиболее распространённый фермент в природе. В результате образуется промежуточное неустойчивое соединение, распадающееся на две молекулы 3-фосфоглицериновой кислоты (ФГК).

Во второй стадии ФГК в два этапа восстанавливается. Сначала она фосфорилируется АТФ под действием фосфороглицерокиназы, затем НАДФН при воздействии триозофосфатдегидрогеназы её карбоксильная группа окисляется до альдегидной и она становится углеводом (ФГА).

В третьей стадии участвуют 5 молекул ФГА, которые через образование 4-, 5-, 6- и 7-углеродных соединений объединяются в 3 5-углеродных рибулозо-1,5-бифосфата, для чего необходимы 3АТФ.

Наконец, две ФГА необходимы для синтеза глюкозы. Для образования одной её молекулы требуется 6 оборотов цикла, 6 CO2, 12 НАДФН и 18 АТФ.

При низкой концентрации растворённого в строме CO2 рибулозобисфосфаткарбоксилаза катализирует реакцию окисления рибулозо-1,5-бифосфата и его распад на 3-фосфоглицериновую кислоту и фосфогликолевую кислоту, которая вынужденно используется в процессе фотодыхания.

Вопрос 2

Биосинтез дезоксирибонуклеотидов.

Рейхард с сотр. показали, что в клетках E.coli восстановление рибонуклеотидов осуществляется на уровне дифосфатов, т.е. АДФ, ГДФ, УДФ и ЦДФ могут непосредственно восстанавливаться в соответствующие дезоксианалоги: дАДФ и т.п. при помощи ферментной системы. В качестве донора протонов в этих реакция участвует белок – тиоредоксин (М 12 кДа), а также рибонуклеозиддифосфатредуктаза, непосредственно осуществляющая реакцию восстановления нуклеозиддифосфат:

Тиоредоксин-(SH) ₂ + XДФ ===> Тиоредоксин-(S-S) + дХДФ + Н ₂О,

где Х – основание.

Поскольку ДНК содержит тимин, то дУДФ превращается в дТДФ при участии тимидилсинтетазы путём переноса метильной группы при участии витамина – тетрагидрофолиевой кислоты (ТГФК).

Синтез дезоксирибонуклеозид-трифосфатов осуществляется в реакциях типа:

дХДФ + АТФ ==> дХТФ + АДФ.

  Распад и утилизация оснований

Свободные основания могут вновь включаться в процессы биосинтеза или разрушаться и выводиться из организма в виде мочевой кислоты, аллантоина, аммиака, мочевины:

Псевдоуридин, образующийся in situ в результате внутренней перестройки, экскретируется из животного организма с мочой в неизменном виде.

Полинуклеотиды

К полинуклеотидам относят РНК и ДНК, играющим ключевые функции в процессе сохранения и передачи наследственной информации.

  Структура ДНК

Только спустя многие десятилетия после её открытия Ф.Мишером в 1869 г. стало понятным, что ДНК является носителем генетической информации.

Первичная структура ДНК представляет собой последовательность азотистых оснований, содержащих в своем составе углеводный остаток – 2'-дезоксирибозу, соединенных фосфодиэфирными связями 5' 3'

Вторичная структура представляет собой двойную спираль, образованную двумя полинуклеотидными цепочками, скрученными в правовращающую спираль вокруг одной и той же оси. Цепи могут быть разделены только путём раскручивания. Они стабилизированы водородными связями комплементарных по отношению друг к другу оснований: между А и Т образуются 2 водородные связи, а между Г и Ц – три. Именно этим объясняются правила Чаргаффа, в основе которых лежат равенства: А=Т и Г=Ц.

Две цепи являются антипараллельными, т.е. направление одной цепи

5'--->3', а другой – 3'--->5'. Одну из двух комплементарных цепей называют кодирующей, а другую – не кодирующей.

Вдоль спирали основания уложены стопкой друг на друга, образуя параллельные плоскости, удерживаемые гидрофобными межплоскостными взаимодействиями оснований (стэкинг-взаимодействия). Двойная спираль – правосторонняя, т.е. закручивается по ходу часовой стрелки. Это описание соответствует В-форме, доминирующей при физиологических условиях (низкая концентрация соли, высокая степень гидратации).

Шаг спирали такой молекулы равен 3,4 нм, число пар оснований на виток равно 10, а диаметр спирали 1,9 нм.

ДНК может образовывать и иные типы двуспиральных структур, обозначаемые буквами А, С, D, Е и Z. Они характеризуются разным числом нуклеотидов на виток и расстоянием между соседними повторяющимися элементами. При этом Z-форма является левозакрученной. Следует отметить, что формы ДНК относятся не ко всей ДНК хромосомы, а – к отдельным её участкам.

Кроме того, in vivo двойная спираль может иметь кольцевую структуру или подвергаться суперспирализации, образуя отрицательные супервитки, закрученные в направлении против часовой стрелки, что приводит к ослаблению напряжения в двойной спирали и даже ее частичному раскручиванию.

Бороздки в структуре ДНК

При рассмотрении модели молекулы ДНК можно обратить внимание на наличие большой и малой бороздок. В них специфические белки могут взаимодействовать с определёнными атомами азотистых оснований, регулируя, таким образом, экспрессию генов.

Особенности биосинтеза ДНК состоят в следующем:

1) он протекает только при наличии всех 4-х дезоксирибонуклеозид-трифосфатов (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дГТФ) в случае синтеза ДНК и всех рибонуклеозидтрифосфатов (АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ) в случае синтеза РНК;

2) биосинтез идет в присутствии специфических ферментов – ДНК или РНК-полимераз;

3) для биосинтеза необходима так называемая "затравка", т.е. исходный материал, с которого происходит копирование вновь образуемых полинуклеотидов.

Реакции могут быть записаны в виде:

n дАТФ дАМФ

+ n дГТФ _________ дГМФ + 4n ФФ

+ n дЦТФ дЦМФ

+ n дТТФ дТМФ n

Реакция синтеза ДНК была предложена А.Корнбергом. Аналогичную запись можно сделать и для синтеза РНК. Фермент РНК-полимеразу впервые выделил С.Шпигельман.

Химизм реакций биосинтеза НК состоит в образовании 5' 3'-связи:

Таким образом, осуществляется ступенчатое присоединение элементов с одного конца. Порядок расположения нуклеозидтрифосфатов вдоль образуемой полинуклеотидной цепи задается чередованием нуклеотидных звеньев, присущих ДНК- или РНК-матрице (затравки). При этом порядок присоединяемых оснований диктуется их комплементарностью по отношению к тем, которые в данный момент находятся на матрице.

Механизм удвоения (репликации) ДНК был установлен в экспериментах Меселсона и Сталя. Выращивая клетки E.coli на среде с меченым 15N источником.

азота с последующим их отмыванием и переносом на среду с немеченым источником азота исследователи отбирали пробы культуры через определенные промежутки времени. Выделение и определение плавучей плотности образцов ДНК методом ультрацентрифугирования позволило прийти к заключению о том, что ДНК синтезируется полуконсервативным путем:

Инициация синтеза ДНК начинается с образования точки роста, определяемой наличием суперспирали и специфических нуклеотидных последовательностей, под действием праймосомы – комплекса белков-ферментов, вовлекаемых в затравочную реакцию. Комплекс включает в себя топоизомеразу (надрезающую одну из цепочек ДНК), ДНК-связывающий, ДНК-раскручивающий белки, ДНК-полимеразный комплекс, а также ДНК-зависимую РНК-полимеразу.

Вначале синтезируется начальный фрагмент – РНК-праймер (содержащий10-200 нуклеотидов), который присоединяется к месту начала синтеза ДНК, после чего рост цепи продолжается уже с участием дезоксирибонуклеотидов. Раскручивание двойной спирали происходит под действием фермента – геликазы за счет энергии АТФ. Молекулы белка, связывающегося с одноцепочечной ДНК, стабилизируют её, и это приводит к образованию репликационной вилки, которая последовательно движется вдоль ДНК от ее стартовой точки. Возможна как одно-, так и дву-направленная репликация.

Поскольку цепи ДНК антипараллельны, то структура одной цепи ориентирована в направлении синтеза от 5'-конца к 3'-концу и называется ведущей. Структура другой синтезируемой цепи направлена от 3'-конца к 5'-концу и называется отстающей. Биосинтез на ведущей цепи идет, как полагают, непрерывно при участии ДНК-полимеразы III.

Синтез отстающей цепи идет несколько иначе.

Наличие РНК-полимеразы в праймазе обеспечивает синтез РНК-праймера, состоящего, из примерно, десятка оснований. ДНК-полимераза III удлиняет праймер в направлении 5'--->3' . Образуются так называемые фрагменты Оказаки длиной 1-2 тыс. нуклеотидов. ДНК-полимераза I отщепляет РНК-праймер и отдельные фрагменты ДНК сшиваются ДНК-лигазой, обеспечивая целостность второй цепочки ДНК.

  Терминация биосинтеза заканчивается при достижении специфической последовательности нуклеотидов.

ДНК прокариот удваивается путем прохождения репликационной вилки вдоль всей молекулы ДНК, а у эукариот этот процесс происходит путем синтеза отдельных участков – репликонов, которые затем сшиваются в единую непрерывную молекулу ДНК.

Вновь синтезированная ДНК далее модифицируется путем метилирования адениновых или цитозиновых остатков ферментом метилазой, что обеспечивает у прокариот узнавание и защиту собственной ДНК от внутриклеточных ферментов рестрикции и приводит к разрушению чужеродного наследственного материала, попавшего в клетку. Метилирование у эукариот имеет целью узнавать гены, находящиеся в различных функциональных состояниях. При этом мы говорим о молчащих последовательностях ДНК и избыточности информации в ней.

Билет 12.