Билет 10 Основные электрофоретические методы разделения и анализы биологических объектов

Электрофорез-разделение ионов при движении их в растворе под действием электрического поля. Многие важные молекула, такие как пептиды и аминокислоты существует в растворе в заряженной форме в виде катионов или анионов. Скорость движения катионов к катоду и анионов к аноду зависит от соотношения между движущей силой электрического поля, действующей на ионы и, и замедляющими движение силами взаимодействия между молекулами и окружающей средой (сила трения). Подлежащий электрофоретическому разделению материал растворяют или суспендируют в буфере. Ток в цепи поддерживается за счёт электролиза, происходящего в электродах, каждый из которых погружен в буферную камеру. В процессе электролиза на катоде образуется молекулярный водород, а на аноде - молекулярный кислород и ионы водорода. Каждая буферная камера разделена на 2 отсека, сообщающихся между собой через небольшие щели. В одном отсеке находится электрод, в другом - носитель в контакте с буфером. Разделение нужно для того, что изменение рН у электрода не сказывалось на изменение рН в отсеке с образцом.

Если снять электрическое поле до того, как ионы исследуемой смеси достигнут электродов, компоненты смеси распределятся в соответствии с их электрофоретической подвижностью. Таким образом, электрофорез представляет собой незавершенную форму электролиза.

Применимость электрофореза для разделения заряженных веществ, начиная от маленьких неорганических ионов и кончая большими макромолекулами, зависит от того, проводится ли он на носителе. Существует много различных типов носителей: листы хроматографической бумаги, тонкие слои окиси кремния и алюминия, агаровые гели и др. Выбор носителя определяется конкретными условиями анализа.

На подвижность образца влияют различные факторы:

А) заряд, размер и форма образца

Б) сила тока, напряжение и сопротивление электрического поля. Кстати, для описания поля используют закон Ома.

В) состав, концентрация, рН (только для органических соединений) буфера. Влияние концентрации: при увеличении ионной силы буфера, миграция образца замедляется. И наоборот.

Г) в качестве носителя используют обычно инертные вещества. Однако их состав всё же подбирается в зависимости от образца. При подборе надо учитывать следующие возможные процессы:

-адсорбция (удерживание молекул образца носителем)

-электроосмос (возникновение заряда между носителем и молекулами воды буфера)

Оборудование.

Принципиальная схема состоит из 2 частей: источник питания и электрофоретический блок (для электрофореза с низким напряжением).

Источник питания: генерирует ток

Электрофоретический блок: состоит из электродов, буферной камеры, опоры для носителей и прозрачной изолирующей крышки.

Основные способы ионизации молекул для их масс-спектрометрического анализа

Существуют различные способы ионизации (приведены в таблице). Но все они делятся на 2 типа:

А) для работы в газовой фазе (для непрямого способа ввода). Для непосвящённых: непрямой ввод означает, что образец надо сначала, например, испарить, а потом уже вводить в спектрометр.

Б) ионизаторы, основанные на явлении десорбции пробы (используются в случае прямого ввода). Прямой ввод: образец помещают в кювету непосредственно в твёрдом или жидком состоянии.

Таблица1-Типы ионизации (кстати, ионизация-это отрыв от молекулы электрона)

Название	Источник ионизации
Ионизация электронным ударом	электроны
Химическая ионизация	Газ-реагент
полевая	Электр. поле
фотоионизация	УФ-излучение
Бомбардировка быстрыми электронами	Ускоренные атомы
Ионизация вторичными ионами	ионы
Есть и др. ещё

Теперь немного поподробнее о каждом. Начнём с типов, которые относятся к первой группе- дл работы в газовой фазе или проще газофазные источники ионизации:

А) ионизация электронным ударом: относится к жёстким способам. Источник высокоэнергетичных электронов-раскалённый вольфрам. КПД у такого метода очень низкий. Т.к. ионизируется только одна миллионная часть молекул пробы. Данный метод самый старый, но и по ныне очень популярный, потому что основная часть таблиц для трактования спектров составлена именно для него. Получаемый спектр богат пиками, однако из-за его сложности, иногда фрагменты не удаётся идентифицировать. Физический принцип: масса электрона значительно меньше, чем масса молекулы, поэтому поступательная энергия почти не изменяется. Однако энергии достаточно, чтобы придать вращательную и колебательную энергию образовавшимся ионам.

Б) химическая ионизация- более мягкий способ, основан на взаимодействии с ионами газа-реагента. Обычно используют метан. Газ ионизируют при помощи электронного удара.

В) полевая ионизация- под действием электрического поля. Отрыв электрона происходит вследствие квантово-механического эффекта. Относится к мягким способам ионизации, спектр прост, пиков мало.

Теперь переходим ко второй группе - десорбционным методам:

А) полевая ионизация – происходит точно так же, как и в газофазной ионизации

Б) бомбардировка быстрыми атомами- используют высокоэнергетические нейтр.атомы, например, аргон. Бомбардировка приводит к появлению ионов, которые в результате десорбции отрываются.