2. Методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов

• Метод Шукевича.

Техника посева. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды дают «ползущий» рост по скошенному агару. Для получения чистой культуры ее отсеивают с верхнего края посева.

Метод прогревания. Позволяет отделить спорообразуюшие бациллы от не споровых форм. Прогревают исследуемый материал на водяной бане при 80°С 10-15 мин. Вегетативные формы погибают, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают.

• Бактериостатический метод (метод ингибирования). Основан на избирательном действии некоторых химических веществ и антибиотиков на микроорганизмы. Например, антибиотики позволяют очистить исследуемый вируссодержащий материал от сопутствующей бактериальной флоры. Серная кислота (5% р-р) быстро убивает большинство бактерий, а туберкулезная палочка выживает в этих условиях.

• Метод заражения лабораторных животных или растений. Применяют в целях выделения и идентификации патогенных микроорганизмов и отделения их от сапрофитной флоры. Для заражения подбирают наиболее восприимчивые к предполагаемому возбудителю инфекции, виды животных или сорта растений. После появления у зараженных организмов признаков болезни их убивают и производят посев органов и тканей на питательные среды. При выделении в изучении облигатных паразитов этот метод явля­ется основным и единственным.

II. Методы создания анаэробных условий

1. Физические методы. Методы основаны на выращивании микроорганизмов в безвоздушной среде.

• Посев в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества;

В качестве редуцирующих веществ обычно используют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кислород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содержание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10-15 мин, а затем быстро охлаждают и заливают сверху небольшим количеством стерильного вазелинового масла. Высота слоя масла в пробирке около 1 см. В качестве легко окисляемых веществ используют глюкозу, лактозу и муравьино-кислый натрий.

Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующим веществами является среда тиогликолевая, которая используется для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выращенной чистой культуры анаэробов.

• Посев микроорганизмов в глубину плотных питательных сред.

• Посев уколом.

Техника посева. Посев уколом в столбик агара (прямой агар) применяется для выращивания анаэробов или выявления характерного признака микроба, так как рост по уколу типичен для ряда бактерий и длительного хранения культур. При посеве уколом в пробирку с прямым агаром или столбиком желатины держат дном кверху, вынимают пробку и обжигают край пробирки. Материал, содержащий микробы, забирают простерилизованной на пламени длинной совершенно прямой платиновой иглой и прокалывают ею столбик питательной среды снизу вверх почти до самого дна пробирки. Вынимают иглу, обжигают край пробирки и пробки, закрывают пробирку, прожигают иглу, ставят ее в подставку, надписывают пробирку и помещают в штатив.

- Посев по способу Веньяль-Вейона,

Техника посева. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диаметром 3-6 мм. Один конец трубки вытягивают в капилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50 С агаром засевают исследуемый материал. Затем помещают агар с посевом в стерильные трубки Веньяль-Вейона. Капиллярный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выделения отдельной колонии трубку надрезают напильником, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ломают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде.

• Механическое удаление воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные микроорганизмы.

Удаление воздуха производят путем его механического откачивания из специальных приборов - анаэростатов, в которые помещают чашку с посевом анаэробов. Переносной анаэростат представляет собой толстостенный металлический цилиндр с хорошо притертой крышкой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.

• Замена воздуха в сосуде каким-либо индифферентным газом.

Замену воздуха индифферентным газом (азотом, водородом, аргоном) можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.

2. Химические методы. Основаны на поглощении кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэростате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия N838204.

3. Биологические методы. Основаны на совместном выращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шириной около 1 см. Получается 2 агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засевают аэроб, например, часто используют S. aureus или Serratia marcescens. На другую сторону засевают анаэроб. Края чашки заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размножаться аэробы. После того как весь кислород в пространстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3-4 суток). В целях сокращения воздушного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоен.

4. Комбинированные методы. Основаны на сочетании физических , химических и биологических методов создания анаэробиоза.