- •Раздел 3
- •Глава 19
- •19.1. Природа и свойства электромагнитного излучения
- •19.2. Классификация спектроскопических методов анализа
- •Вид используемого электромагнитного излучения
- •Глава 20
- •20.1. Основной закон поглощения электромагнитного излучения
- •20.2. Отклонения от основного закона светопоглощения
- •20.3. Атомно-абсорбционная спектроскопия
- •20.3.1. Процессы, приводящие к появлению аналитического сигнала
- •20.3.2. Измерение аналитического сигнала
- •20.3.3. Практическое применение
- •20.4. Молекулярная абсорбционная спектроскопия в уф- и видимой области
- •20.4.1. Молекулярные спектры поглощения в уф- и видимой области
- •20.4.2. Измерение аналитического сигнала
- •20.4.3. Практическое применение и основные приёмы фотометрического анализа
- •Фотометрические реакции
- •Дифференциальная (разностная) фотометрия
- •Производная спектрофотометрия
- •20.5.1. Процессы, приводящие к появлению аналитического сигнала
- •20.5.2. Общая характеристика ик-спектров
- •20.5.3. Измерение аналитического сигнала
- •20.5.4. Практическое применение
- •Глава 21
- •21.1. Атомно-эмиссионная спектроскопия
- •21.1.1. Процессы, приводящие к появлению аналитического сигнала
- •21.1.2. Измерение аналитического сигнала
- •21.1.3. Практическое применение
- •20.2. Люминесцентная спектроскопия
- •20.2.1 Классификация видов люминесценции
- •21.2.2 Механизм молекулярной фотолюминесценции. Флуоресценция и фосфоресценция
- •21.2.3 Основные характеристики и закономерности люминесценции
- •21.2.4. Влияние различных факторов на интенсивность флуоресценции растворов
- •Природа вещества
- •21.2.5. Измерение аналитического сигнала
- •21.2.6. Практическое применение и основные приёмы люминесцентного анализа
- •Глава 22
- •22.1. Общая характеристика
- •22.2. Классификация хроматографических методов
- •22.3. Хроматографические параметры
- •Хроматографические характеристики, используемые для идентификации веществ (характеристики удерживания)
- •Хроматографические характеристики, используемые для количественного определения веществ
- •22.4. Теории хроматографического разделения
- •Глава 23
- •23.1. Общая характеристика
- •23.2. Устройство газового хроматографа
- •Хроматографическая колонка
- •Детекторы
- •23.3. Особенности газотвёрдофазной хроматографии
- •23.4. Особенности газожидкостной хроматографии
- •23.5. Индексы удерживания Ковача
- •23.6. Практическое применение
- •Глава 24
- •24.1. Общая характеристика
- •24.2. Плоскостная хроматография
- •24.2.1. Методика получения плоскостной хроматограммы
- •24.2.2. Анализ плоскостной хроматограммы
- •24.2.3. Практическое применение
- •24.3. Колоночная жидкостная хроматография
- •24.3.1. Устройство жидкостного хроматографа
- •24.3.2. Практическое применение
- •24.4. Характеристика отдельных видов жидкостной хроматографии
- •24.4.1. Ионообменная хроматография
- •Неподвижные и подвижные фазы
- •24.4.2. Эксклюзионная хроматография
- •Глава 25
- •25.1. Основные понятия, связанные с электрохимическими методами анализа
- •25.2. Классификация электрохимических методов анализа
- •В табл. 25.1 приведена классификация основных электрохимических методов анализа в зависимости от измеряемого параметра.
- •25.3. Кондуктометрия
- •25.3.1. Теоретические основы и классификация
- •25.3.2. Измерение аналитического сигнала
- •25.3.4. Практическое применение
- •25.3.5. Понятие о высокочастотной кондуктометрии
- •Глава 26
- •26.1. Потенциометрический метод анализа
- •26.1.1. Общая характеристика и классификация
- •26.1.2. Условия измерения аналитического сигнала
- •26.1.3. Индикаторные электроды
- •26.1.4. Прямая потенциометрия
- •26.1.5. Потенциометрическое титрование
- •26.2. Кулонометрический метод анализа
- •26.2.1. Общая характеристика и классификация
- •26.2.2. Прямая кулонометрия
- •1) Рабочий электрод;
- •2) Электрод сравнения;
- •3) Вспомогательный электрод
- •26.2.3. Кулонометрическое титрование
- •Глава 27
- •27.1. Принцип измерения аналитического сигнала.
- •27.2. Вольтамперограмма
- •27.3. Некоторые современные разновидности вольтамперометрии
- •27.4. Практическое применение вольтамперометрии. Амперометрическое титрование
21.2.5. Измерение аналитического сигнала
Для измерения интенсивности флуоресценции используют спектрофлуориметры и флуориметры (на рис. 21.5).
В качестве источника излучения используют ртутную, ксеноновую и другие лампы. В последнее время для возбуждения флуоресценции применяют лазеры.
Для выделения нужного спектрального интервала в флуориметрах, как и в фотоэлектроколориметрах, используют светофильтры, а в спектрофлуориметрах, также как и в спектрофотометрах - монохроматоры (дифракционные решётки или призмы). Светофильтр (монохроматор), используемый для выделения необходимого возбуждающего излучения, называется первичным, а для выделения наиболее интенсивного излучения из спектра испускания - вторичным.
Рис. 21.5. Принципиальная схема прибора для измерения интенсивности флуоресценции
Измерение флуоресценции, в отличие от измерения поглощения, чаще всего проводят под прямым углом к направлению возбуждающего света. Такой приём позволяет избежать наложения возбуждающего света на излучаемый. При измерении интенсивности фосфоресценции, либо при большом Стоксовом сдвиге, можно использовать схему, при которой источник возбуждения, образец и детектор находятся на одной оптической оси. В данном случае возбуждающий свет не мешает определению, так как при измерении интенсивности фосфоресценции измерение проводят после прекращения действия возбуждающего света, а при большом Стоксовом сдвиге возб и исп настолько различаются, что возбуждающий свет задерживается монохроматором и не попадает на детектор. В случае сильно поглощающих растворов, полупрозрачных и твёрдых образцов используют фронтальный способ, при котором измерение флуоресценции проводится под углом 45 относительно возбуждающего излучения.
При измерении флуоресценции имеют дело со слабым излучением, поэтому в качестве детектора используют не фотоэлементы, как в спектрофотометрии, а фотоумножители.
21.2.6. Практическое применение и основные приёмы люминесцентного анализа
К люминесцентной спектроскопии относят:
-
флуоресцентный метод анализа (флуориметрия),
-
фосфоресцентный метод анализа (фосфориметрия),
-
хеми- и биолюминесцентный метод анализа (люминометрия) и др.
Наиболее широкое применение среди перечисленных люминесцентных методов анализа имеет флуориметрия. По сравнению со спектрофотометрией флуориметрия обладает:
-
большей избирательностью (не все вещества, поглощающие УФ- и видимое излучение, способны флуоресцировать);
-
более низким пределом обнаружения (измерить абсолютную величину малого сигнала всегда легче, чем разность между двумя большими сигналами);
-
удобным временным диапазоном.
Поглощение света - это практически мгновенный процесс (10-15 - 10-16 с), флуоресценция длится около 10 нс (а фосфоресценция значительно дольше). За это время с молекулой могут произойти различные процессы, которые влияют на характеристики флуоресценции. Данное свойство широко используется в биохимии для изучения строения мембран, диффузии биомолекул, динамики связывания антигенов и антител. Влияние вращения молекул антигенов (лекарств, ядов), меченых флуоресцеином, на поляризацию флуоресценции последнего лежит в основе поляризационного флуороиммуноанализа, одного из современных методов анализа биологических объектов.
Флуоресцентный анализ используют для обнаружения и для количественного определения веществ. В качественном анализе чаще всего используется способность вещества флуоресцировать тем или иным цветом. При этом в качестве источника возбуждения обычно используют УФ-лампу, а наличие или отсутствие флуоресценции определяют визуально. Таким образом, например, обнаруживают флуоресцирующие вещества на плоскостных хроматограммах.
В количественном анализе используют зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации флуоресцирующего вещества либо, реже, зависимость уменьшения интенсивности флуоресценции от концентрации тушителя, в роли которого выступает вещество, концентрацию которого необходимо определить.
В флуоресцентном анализе используется:
-
измерение собственной флуоресценции вещества;
-
получение флуоресцирующих продуктов, в том числе и экстракционная флуориметрия;
-
определения, основанные на тушении флуоресценции;
-
титрование с флуоресцентными индикаторами и др.
Флуориметрическое определение, основанное на собственной флуоресценции, используется для определения хинина, берберина, рибофлавина, фторхинолонов, флуоресцеина и т.д.
Обратите внимание на особенности структуры флуоресцирующих веществ – наличие в составе их молекул конденсированных ароматических систем.
В основе реакций получения флуоресцирующих продуктов могут лежать различные процессы: окисления, конденсации, образование комплексных соединений, ионных ассоциатов и др. Если образующийся продукт мало растворим в воде, неустойчив в водном растворе, либо избыток реагента мешает определению или влияет на устойчивость продукта, применяют экстракционную флуориметрию. Иногда вещество не флуоресцирует или слабо флуоресцирует в водной среде, но интенсивно флуоресцирует в среде органического растворителя.
Флуориметрическое определение, основанное на тушении флуоресценции, применяют для определения сульфаниламидов (тушат флуоресценцию 9-хлоракридина), -лактамных антибиотиков (тушат флуоресценцию меркурохрома) и т.д.
К новым подходам в люминесцентной спектроскопии относятся:
-
производная спектрофлуориметрия;
-
синхронная спектрофлуориметрия;
-
спектроскопия, основанная на эффекте Шпольского;
-
флуоресцентная спектроскопия узких линий,
-
фосфориметрия при комнатной температуре и др.