Клітинна інженерія

ПЛАН

1. Методи й умови вирощування ізольованих клітин і тканин рослин.

2. Соматична гібридизація рослин та її перспективи.

3. Культивування і застосування тваринних культур тканин.

4. Моноклональні антитіла. Трансплантація ядер.

5. Клонування.

1. Методи й умови вирощування ізольованих клітин і тканин рослин

Застосування ізольованої культури тканин, а також тотипотентності рослинних клітин розкрило великі можливості у вирішенні глобальних теоретичних і практичних завдань. У галузі фундаментальних наук стало можливим дослідження таких складних проблем як взаємодія клітин у тканинах, клітинне диференціювання, морфогенез, реалізація тотипотентності клітин, механізми появи ракових клітин.

При вирішенні практичних завдань основну увагу приділяють питанням селекції, одержанню значної кількості біологічно-цінних метаболітів рослинного походження (ліків), а також вирощування оздоровлених безвірусних рослин.

Правила асептики дотримуються в асептичних кімнатах або ламінарному боксі. Це потік стерильного повітря з боксу на працівника, УФ лампи і стерильний одяг, стерилізація спиртом інструментів, столів, сушильна шафа (150⁰С), автоклавування (120⁰С) поживних середовищ, або пропускання їхніх компонентів через бактеріальні фільтри. Рослинні тканини стерилізуються у дезинфікуючих розчинах (Н₂О₂ 10-12%, сулема 0,1%, діацид 0,1%) або антибіотиках, промивають дистильованою водою, зрізають верхній шар клітин скальпелем.

До складу всіх поживних середовищ входять вуглеводи, вітаміни, мікро- і макроелементи (NO₃, Р, К), фітогормони і їх синтетичні аналоги. Обов’язковий розчин 2-3% сахарози або глюкози, так як у більшості калюсної тканини (крім амаранта, мандагори та ін.) відсутній хролофіл, тому вирощують її у темноті або розсіяному світлі. Ауксини визивають дедиференціювання клітин експлантата, цитокініни – індукують поділ.

Виснаження поживного середовища значно знижує ріст і процеси метаболізму, але встановлено, що низький вміст фосфатів стимулює синтез вторинних метаболітів (фенольних сполук). У середовище можуть добавляти ендосперм зародків кінського каштана, кокосового горіха та ін.

Саме універсальне середовище Мурасіге і Скуга. (табл.)

Світло може активізувати процеси і забезпечувати морфогенез. Використовують люмінесцентні лампи. У кожному окремому випадку підбирають оптимальну інтенсивність освітлення і режим (безперервний, УФ, певної довжини хвиль). Для більшості культур оптимальна температура 26⁰С, але для утворення метаболітів у деяких випадках необхідне зниження до 18-20⁰С. Дуже важлива аерація, вологість у боксах 60-70%.

2. Соматична гібридизація рослинних клітин та її перспективи.

Селекція рослин — одна із найдавніших біотехнологій, створених людиною. Людина окультурила рослини понад 10 000 років тому, і з того часу почався відбір диких та культурних видів рослин за ознаками їх найбільшого використання.

Селекційний процес сільськогосподарських рослин тепер потребує не тільки нових знань у галузі біологічних наук, але і створення нових технологій, методів, прийомів, які можуть покращити, прискорити, полегшити та знизити витрати на отримання вихідного матеріалу, або сорту.

Одним з таких методів є гібридизація соматичних клітин рослин шляхом злиття ізольованих протопластів — один із способів утворення генетично змінених форм рослин. Суть цього методу в отриманні гібридів вищих рослин полягає в тому, що як батьківські клітини використовуються не статеві клітини (гамети), а клітини тіла (соми) рослин. У таких клітин за допомогою спеціальної ферментної обробки видаляють тверді полісахаридні оболонки. Протопласти рослин можна одержати шляхом механічної дії (центрифугуванням). Голі клітини — ізольовані протопласти при експериментальній дії зливаються одна з одною. Злиття протопластів бактерій (рослин) здійснюють під дією індукторів: СаСl₂ або поліетиленгліколю (ПЕГ), при використанні яких найбільша частота злиття. Із гібридних клітин, отриманих шляхом злиття, регенерують цілі рослини — соматичні гібриди. У процесі культивування ізольовані протопласти регенерують нову клітинну оболонку і перетворюються в звичайну клітину, культивовану in vitro.

Деякі властивості ізольованих протопластів (здатність до утворення нової клітинної оболонки та злиття між собою) відомі вже понад 90 років. Але історія розвитку методу культури ізольованих протопластів вищих рослин бере свій початок з 1960 року, коли англійський дослідник Коккінг, обробляючи кінчики кореня томату гідролітичними ферментами із культуральної рідини цвільових грибів, вперше отримав ізольовані протопласти.

Голі клітини, або ізольовані протопласти, експериментальним шляхом можна примусити зливатися одну з одною або поглинати з поживного середовища макромолекули (білки, нуклеїнові кислоти). Ці методи дозволяють маніпулювати із вмістом рослинних клітин. Це відкриває шлях до парасексуальної гібридизації вищих рослин — гібридизації в обхід статевого схрещування. Це дозволяє:

1. схрещувати філогенетично віддалені види рослин, які неможливо схрестити статевим шляхом;

2. отримувати асиметричні гібриди, які несуть генний набір одного із батьків з кількома хромосомами іншого;

3. створити систему гібридизації, яка включає злиття трьох і більше батьківських форм;

4. отримати гібриди які в генетичному розумінні є сумою ідіотипів батьків;

5. одержати рослини, гетерозиготні за позаядерними генами;

6. схрещувати форми які неможливо гібридизувати статевим шляхом через аномалії в морфогенезі.

До середини 70 років, тобто до початку розробки способу соматичної гібридизації, багато дослідників вважали, що можна отримувати будь-які віддалені гібриди. Дійсно, видоспецифічність протопластів не була виявлена на етапі злиття. Несумісність злиття відсутня навіть між тваринними і рослинними протопластами. Детальне вивчення яке відбулося пізніше, виявило, що на подальших етапах в таких гібридах починаються різного роду несумісності.

Нормальні соматичні гібриди, здатні до статевого розмноження, отримані поки що в межах роду. У міру збільшення віддаленості при соматичній гібридизації збільшується несумісність. Наприклад, в міжродових гібридів (беладона — тютюн, картопля — тютюн) не утворюються ферментильні рослини, у більш віддалених міжродинних гібридів (тютюн — соя, тютюн — боби) відсутнє регулярне генетичне відтворення клітин при поділі, а у гібридів людина — морква взагалі відсутнє розмноження гібридних клітин. Проте для практичної селекції рослин однією з основних проблем є схрещування не дуже далеких видів, які не схрещуються статевим шляхом. При соматичній гібридизації позаядерні гени успадковуються двобатьківські, а ядерні гени одно- і двобатьківські. При статевій гібридизації позаядерні гени успадковуються тільки однобатьківські (материнські), а ядерні — тільки двобатьківські. Вважається, що при соматичній гібридизації можна одержати 12 життєздатних продуктів злиття, а при статевому процесі — тільки 2 комбінації (АВ і ВА). Деякі ядерноплазматичні комбінації, отримані при соматичній гібридизації, неможливо одержати при статевому методі.

Серед досягнень в області генетики останніх десятиріч — відкриття наявності генів в цитоплазмі клітин. Сьогодні вже доведено, що 99% генетичної інформації в рослині знаходиться у клітинному ядрі. Проте в органоїдах клітин — хлоропластах і мітохондріях — є невеликі генетичні системи (по 100 — 200 генів). Вони є незамінними генетичними системами. Під контролем генів цих органоїдів знаходиться ціла низка корисних для людини ознак — інтенсивність фотосинтезу та дихання, стійкість до хвороб, стресів, фізичних факторів, гербіцидів.

Використання позаядерних генів у статевому процесі неможливе, бо вони успадковуються лише по материнській лінії.

Головна особливість техніки соматичної гібридизації полягає в тому, що можливе отримання гібридів, які несуть частину цитоплазми одного батька з частиною цитоплазми другого. Важливим практичним результатом є роботи щодо пересадки генів хлоропластів за допомогою злиття протопластів, які визначають стійкість до гербіциду атразину, наприклад, від суріпиці до турнепсу чи рапсу, від пасльону чорного до картоплі тощо.

Наступний напрямок — перенос фрагментів хромосом. Кінцевою метою міжвидової соматичної гібридизації є передача культурному сорту (реципієнту) декілька цінних генів дикого виду (донора). Оскільки цей гібрид має половину ядерного матеріалу батьків (статевий процес за своєю природою симетричний), мета досягається шляхом багаторазових зворотних схрещувань даного гібриду з культурним сортом. Цей процес довготривалий (до 9 років) і далеко не завжди приводить до бажаного результату.

Соматична гібридизація дозволяє за один цикл створити такі гібриди, які назвали асиметричними. Індукція асиметрії соматичних гібридів досягається шляхом попереднього опромінення клітин — рослини-донора (як правило, дикого виду) іонізуючим випромінюванням. Кількість передачі генного матеріалу від опроміненої клітини лімітується дозою опромінення (як правило, 5—30 крад). Позитивні результати дослідів такого плану вже проведені з картоплею, тютюном, морквою.

Перші результати щодо трансформування вищих рослин чужорідними генами були одержані у 1980-х роках. У наш час вже одержані рослини, які несуть гени стійкості до антибіотиків і гербіцидів, а також рослин, чужорідні гени яких впливають на підвищену стійкість рослинного організму до вірусів і комах.

Отже, соматична гібридизація може бути використана для одержання великої різноманітності рослин як за генотипом, так і за фенотипом, а також для генетичного конструювання нових форм рослин.

Відбір гібридів із суміші клітин проводять селекцією, а також трудоємким методом скринінгу. Найбільш розповсюджена система відбору за допомогою селективного середовища (ГАТ) (містить гіпоксантин, аміноптерин і тімідин). У батьківських клітинах відсутній (дефектний) один з генів, що відповідає за синтез фермента, який дозволяє використовувати ці сполуки. Здатність до поділу матимуть лише клітинні гібриди, у яких активні обидва ферменти (тімідинкіназа (ТК) і інозинпірофосфорилаза ІРР), решта клітин гине.

Відбір може відбуватись у результаті комлементації ауксотрофних і температурних мутацій а частіше для цього використовуються маркери стійкості до хімічних речовин.