- •Київський національний університет імені тараса шевченка
- •Протокол № засідання кафедри
- •Вплив антибіотиків групи цефалоспоринів на оксидантно-антиоксидантну систему слизової оболонки товстої кишки щурів.
- •3.7.1. Визначення дієнових кон’югатів ненасичених жирних кислот..19
- •Список скорочень
- •Моніторинг клінічного стану щурів на фоні 5-ти добового та 14-ти добового введення цефтріаксону.
- •Дослідження активності сод в слизовій оболонці тк щурів після 5-ти та 14-ти добового введення цефтріаксону.
- •1.2 Класифікація цефалоспоринів
- •1.3 Біологічна активность цефтріаксону
- •Антибіотик асоційована діарея та механізми її розвитку
- •Експериментальна частина розділ 3 матеріали та методи досліджень
- •3.1. Матеріали
- •3.2. Лабораторні тварини
- •3.3. Схема проведення експерименту
- •3.4. Моніторинг клінічних параметрів стану щурів
- •3.5. Отримання гомогенату слизової оболонки
- •3.6. Визначення концентрації протеїнів методом Лоурі
- •3.7.1. Визначення дієнових кон’югатів ненасичених жирних кислот
- •3.7.2. Визначення вмісту тбк-активних продуктів
- •3.7.3. Визначення активності каталази.
- •3.7.4. Визначення активності сод
- •3.8. Статистична обробка даних
- •Розділ 4 результати досліджень та їх обговорення
- •4.1.Моніторинг клінічного стану щурів на фоні 5-ти добового та 14-ти добового введення цефтріаксону
- •4.2. Дослідження активності сод в слизовій оболонці товстої кишки щурів після 5-ти та 14-ти добового введення цефтріаксону
- •4.2. Дослідження активності каталази
- •4.4. Дослідження вмісту дієнових кон'югатів
- •4.3. Дослідження вмісту мда
- •Висновки
- •Список використаних джерел
3.7.1. Визначення дієнових кон’югатів ненасичених жирних кислот
У щільно притертий скляний гомогенізатор Поттера поміщали аліквоту, що містила 0,1 мг протеїну досліджуваного зразка, додавали 5 мл суміші гептан/ізопропіловий спирт у співвідношенні 1:1 та гомогенізували 10 хв. Проби центрифугували (1000 g, 15 хв) у пробірках з притертою пробкою.
Відбирали надосадову рідину та додавали до неї 0,5 мл дистильованої води для розшарування фаз гептану та ізопропілового спирту. Верхню гептанову фазу відбирали для визначення вмісту шиффових основ на флуорометрі RF-510, (Shimadzu, Японія) за умов λзбуд =360 нм і λеміс =420 нм. Для визначення дієнових кон’югатів у хімічні пробірки відбирали по 0,3 мл гептанової фази, додавали 1,5 мл 96% етилового спирту, проби перемішували, вимірювали поглинання при λ=233 нм на спектрофотометрі-46 (ЛОМО, Росія). Вміст дієнових кон’югатів у пробі розраховували з величини молярного коефіцієнта екстинції при 233 нм для спряжених дієнів поліненасичених жирних вищих кислот, ε = 1,56 х 105 см-1х М-1 на мг протеїну [23].
3.7.2. Визначення вмісту тбк-активних продуктів
Вміст ТБК-активних продуктів оцінювали згідно методу Стальної. Аліквоту клітинної суспензії, що містила 0,5 мг білку доводили до загального об'єму 0,5 мл буфером (мМ): KCl - 175, трис-HCl - 25, рН=7,4, об’єм проби становив 0,5 мл. Після цього відразу додавали 0,2 мл 20% трихлороцтової кислоти (ТХО). Денатурований протеїн осаджували центрифугуванням (1000 g, 15 хв). До 0,5 мл отриманого супернатанту додавали додавали 0,25 мл 0,8% тіобарбітурової кислоти (ТБК), суміш інкубували на киплячий водяній бані 10 хв для розвитку забарвлення. Визначення забарвлення проводили на спектрофотометрі (СФ-46, ЛОМО, Росія) при l=532 нм.
Вміст ТБК-активних продуктів на 1 мг білка розраховували на основі значення молярного коефіцієнта екстинкції комплекса малонового діальдегіду з 2-тіобарбітуровою кислотою: ε = 1,56 х 105 см-1х М-1 [24].
3.7.3. Визначення активності каталази.
Каталаза (Пероксид водню: пероксид водню-оксидоредуктаза) [КФ 1.11.1.6]. Принцип методу полягає в тому, що каталаза руйнує субстрат Н2О2, незруйнована частина пероксиду водню при взаємодії з солями молібдену утворює стійкий забарвлений комплекс.
У пробірки вносили 2 мл 0,03 % розчину пероксиду водню. Реакцію починали додаючи 0,1 мл гомогенату (0,1 мг білка) до необхідної концетнрації доводили за допомогою H2O дист. У холосту пробу додавали 0,1 мл дистильованої води. Проби витримували при кімнатній температурі 10 хв, реакцію зупиняли додаванням 1 мл 4 %-го розчину молібдату амонію. Інтенсивність забарвлення вимірювали на спектрофотометрі-46 при =410 нм проти контрольної проби, у яку замість пероксиду водню додавали 2 мл Н2О.
Активність каталази розраховували за формулою:
Е= (Ахол - Адосл) ,
K х t х а
де Е – активність каталази, Ахол і Адос - екстинція холостої та дослідної проб, K – коефіцієнт мілімолярної екстинкції перекису водню, що дорівнює 22,2 х 103 мМ-1 х см-1, t – час інкубації 10 хв., а – вміст білку в пробі, мг. Активність визначали у нМоль Н2О2/ хв * 1 мг білка.