Лабораторная работа 4. Определение изоэлектрической точки желатина.

В изоэлектрической точке растворы белков неустойчивы и белок легко выпадает в осадок. Выпадение белка в осадок можно ускорить добавлением веществ, разрушающих гидратную оболочку белковых макромолекул (спирт, ацетон).

Реактивы и оборудование: 0,5%-ный раствор белка желатина, 0,1 н раствор уксусной кислоты, 0,1 н раствор уксуснокислого натрия, 96%-ный этиловый спирт, мерные пипетки на 2 мл.

Выполнение работы. Для определения изоэлектрической точки желатина в пять пробирок наливают растворы уксусной кислоты и уксуснокислого натрия в количествах, указанных в таблице 1. После чего в каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора желатина и хорошо перемешивают, затем прибавляют по 4 мл этилового спирта и осторожно перемешивают стеклянной палочкой. Через 5-10 минут оценивают степень мутности каждой смеси по пятибалльной системе. рН наиболее мутной смеси соответствует изоэлектрической точке желатина. Результаты опыта записывают в таблицу 1.

Таблица 1. Определение изоэлектрической точки белка желатина.

№ про-бирки	Состав буферной смеси, мл		рН смеси	Объем раствора желати-на, мл	Объем этилового спирта, мл	Степень мутнос-ти
	0,1 н СН3СООH	0,1 н СН3СООNa
1 2 3 4 5	1,8 1,4 1,0 0,6 0,2	0,2 0,6 1,0 1,4 1,8	3,8 4,4 4,7 5,1 5,7	1 1 1 1 1	4 4 4 4 4

Контрольные вопросы.

1. Что такое изоэлектрическая точка белка?

2. Почему в изоэлектрической точке растворы белков неустойчивы?

3. Как влияет на осаждение белков добавление этанола?

4. Для каких целей при проведении лабораторной работы используется буферная смесь?

Лабораторная работа 5. Нуклеопротеиды. Выделение нуклеопротеидов из дрожжей и определение их состава.

Нуклеопротеиды - сложные белки, простетической группой которых являются нуклеиновые кислоты (дезоксирибонуклеиновая - ДНК и рибонуклеиновая - РНК). Они представляют собой слож­ные агрегаты, построенные из 1-2 молекул нуклеиновой кислоты и большого числа прикрепленных к ним белковых субъединиц. Связь между белком и нуклеиновыми кислотами осуществляется за счет ионных, водородных и гидрофобных взаимо­действий.

Нуклеиновые кислоты характеризуют­ся определенным составом и распадаются:

- при неполном ферментатив­ном гидролизе РНК и ДНК, щелочном гидролизе РНК (ДНК не гидролизуются под действием щелочей) до структурных единиц нуклеиновых кислот – мононуклеотидов.

- при полном гидролизе мононуклеотидов до пуриновых (аденина, гуанина) и пиримидиновых (цитозина, тимина – только в ДНК, урацила – только в РНК) азотистых оснований, пентоз (рибозы – в РНК, дезоксирибозы – в ДНК) и фосфорной кислоты.

Нуклеопротеидами богаты печень, селезенка, поджелудочная железа, почки. Доступным и удобным объектом, особенно богатым нуклеопротеидами, являются дрожжи. Нуклеопротеиды извлекаются из дрожжевых клеток при механическом разрушении клеток. Дальнейшее их выделение связано со свойством нуклеопротеидов растворяться в разбавленных растворах щелочей и легко осаждаться при подкислении раствора. При непродолжительном гидролизе дрожжевой массы или выделенных из нее нуклеопротеидов последние распадаются на полипептиды, пуриновые и пиримидиновые основания, рибозу и дезоксирибозу , фосфорную кислоту.

Продукты гидролиза нуклеопротеидов могут быть обнаружены в гидролизате специфическими для каждого соединения реакциями.

Реактивы и оборудование: дрожжи, диэтиловый эфир, 5%-ный раствор уксусной кислоты, 0,4, 10, 30%-ные растворы гидроксида натрия, 10%-ный раствор серной кислоты, 25%-ный раствор аммиака, 1%-ный раствор нитрата серебра, 1, 7%-ные растворы сульфата меди, этанол, молибденовый реактив (3,75 г молибдата аммония растворяют в 50 мл воды и добавляют 50 мл 32%-ного раствора азотной кислоты), ступки с пестиками, центрифуга, центрифужные пробирки, технические весы, пипетки, стеклянный лом, стеклянные палочки, фарфоровые чашки, бумажные фильтры, воронки, воздушный холодильник, электрическая плитка, спиртовки, пробирки.

Выполнение работы.