И Н С Т Р У К Ц И Я

по выполнению практической работы № 50 по теме

«Обмен белков. Определение содержания мочевины в сыворотке крови колориметрическим методом на основе реакции с диацетилмонооксимом»

Цели занятия:

1. Закрепить теоретические знания по теме «Химия и обмен белков».

2. Закрепить умения и навыки в работе с набором реактивов, приготовлении растворов.

3. Сформировать умения в постановке реакции преципитации.

4. Провести биохимическое исследование – определение содержания мочевины в сыворотке крови колориметрическим методом на основе реакции с диацетилмонооксимом.

Исходный уровень знаний и умений.

Учащийся должен знать:

1. Основные этапы обмена белков, их биологическую роль.

2. Роль лабораторной диагностики в исследовании белкового обмена пациента.

3. Патологические состояния обмена белков.

4. Пути метаболизма аминокислот, медико-биологическое значение.

5. Защитные реакции по обезвреживанию аммиака. Синтез мочевины. Локализацию процесса. Реакции. Ферменты.

6. Значение реакций детоксикации аммиака в норме и при патологии.

7. Технику приготовления растворов и реактивов.

8. Технику дозирования, пипетирования, инкубации проб.

9. Технику работы с водяной баней.

10. Технику работы на ФЭКе, спектрофотометре; меры предосторожности в работе с приборами, водяной баней, реактивами.

11. Иметь понятие о контроле качества лабораторных исследований.

Учащийся должен уметь:

1. Работать с набором реактивов.

2. Работать с пипетками, дозатором.

3. Работать на спектрофотометре, ФЭКе.

4. Провести биохимическое исследование по предложенной методике.

5. Дать начальную интерпретацию полученным результатам.

6. Уметь решать ситуационные задачи.

Структура занятия.

1. Теоретическая часть:

1. Повторение теоретического материала по теме «Химия и обмен белков».

2. Вводное слово преподавателя.

Мочевина представляет собой диамид угольной кислоты (NH₂)₂CO, образующийся в печени в процессе обезвреживания аммиака. Мочевина входит в остаточноазотную фракцию; азот мочевины у практически здоровых людей составляет 40-60% всего остаточного азота, выраженного в мг/100 мл. Разность между остаточным азотом и азотом мочевины представляет так называемый резидуальный азот. Под остаточным азотом понимают тот небелковый азот, который определяется в надосадочной жидкости, получаемой после осаждения белков сыворотки (плазмы) крови ТХУ фосфорно-молибденовой и фосфорно-вольфрамовой кислотами.

При острой почечной недостаточности, когда остаточный азот крови может быть в пределах нормы, резко увеличивается концентрация мочевины (уремия), так как выделение её с мочой нарушается. Для оценки тяжести состояния определяют отношение азота мочевины к остаточному азоту и эту величину выражают в процентах. В норме данный показатель составляет 48%, а при почечной недостаточности может достигать 90%.

Снижение уровня мочевины характерно для заболеваний печени (паренхиматозная желтуха, острая дистрофия печени, цирроз).

2. Указания к занятию. Методические рекомендации:

   1. Внимательно изучите инструкцию.

   2. Приготовьте всё необходимое для проведения анализа.

   3. Осмыслите ход выполнения лабораторной работы.

   4. В работе желательно использовать параллельные пробы с целью самоконтроля за качеством работы.

   5. Соблюдайте меры предосторожности в работе с реактивами, биологическим материалом, на спектрофотометре.

   6. При работе с градуированной пипеткой используйте резиновую грушу с переходником.

   7. Соблюдайте дезинфекционный режим в работе.

Практическая часть.

1. Приготовление рабочего реагента (используется набор реактивов «Абрис+»).

Опыт 1. Приготовление рабочего реагента.

Выполнение опыта:

Смешать растворы диацетилмонооксима, железа солянокислого и тиосемикарбазида в соотношении 1:1:1. Рабочий реагент стабилен не менее 8 часов при комнатной температуре в герметично закрытом флаконе.

2. Лабораторная работа: «Определение содержания мочевины в биологических жидкостях колориметрическим методом на основе реакции с диацетилмонооксимом».

ПРИНЦИП: Мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов Fe³⁺ комплексное соединение красного цвета, по интенсивности окраски которого определяют её концентрацию.

Оборудование: штатив с пробирками, водяная баня, центрифуга, пипетки, химические стаканы; спектрофотометр.

Реактивы: цветной реагент, содержащий диацетилмонооксим; тиосемикарбазид; соль Fe (III); стандартный раствор мочевины, раствор ТХУ – 30%.

Материал для исследования: сыворотка крови, моча.

Проведение анализа.

Отмерить	Опытная проба, мл	Калибратор, мл	Контроль, мл
Сыворотка крови	0,01	-	-
Рабочий раствор цветного реагента	2,0	2,0	2,0
Дистиллированная вода	-	-	0,01
Калибратор	-	0,01	-

Смешать и инкубировать в кипящей водяной бане в течение 10 мин. По окончании инкубации пробы охладить в проточной воде и измерить оптическую плотность пробы (Е_пр.) и калибратора (Е_кал.) против контрольного раствора при длине волны 540 (500-560) нм, кювета – 1 см. Окраска стабильна в течение 15 мин.

Расчёт:

, ммоль/л,

где C_кал. – концентрация мочевины в калибраторе; E_пр. – оптическая плотность опытной пробы; E_кал. – оптическая плотность стандартной пробы.

Примечание: Если определяют мочевину в гемолитических или липемических сыворотках, то пробу необходимо депротеинировать 10% раствором ТХУ. В центрифужную пробирку вносят 0,4 мл дистиллированной воды, 0,1 мл сыворотки и 0,5 мл 10% раствора ТХУ. Содержимое смешивают и центрифугируют 5-10 мин. при 3000 об/мин. Затем 0,01 мл надосадочной жидкости переносят в новую пробирку, добавляют 2,0 мл рабочего раствора цветного реагента. Далее определение проводят, как при анализе без депротеинирования

Мочу перед анализом разводят дистиллированной водой в соотношении 1:50, 1:100 и исследование проводят в той же последовательности, как описано для сыворотки..

Расчёт:

, ммоль/л,

где K – коэффициент разведения; V_сут. – объём суточной мочи, л.

Референтные пределы: в сыворотке крови – 2,5-8,1 ммоль/л; моча суточная – 430-710 ммоль/ сут.