И Н С Т Р У К Ц И Я

по выполнению практической работы № 64 по теме

«Химия крови. Определение количества билирубина в сыворотке крови по методу Йендрашина».

Цели занятия:

1. Закрепить теоретические знания по теме «Химия крови».

2. Закрепить навыки и умения в работе с наборами реагентов, в приготовлении растворов.

3. Провести биохимическое исследование – определение количества билирубина в сыворотке крови.

Исходный уровень знаний и умений.

Учащийся должен знать:

1. Понятие о крови как единой биохимической системе в организме человека.

2. Основные компоненты крови, их биологическую роль.

3. Патологические состояния, наблюдаемые в биохимической картине крови.

4. Роль лабораторной диагностики в исследовании крови как важнейшего источника сведений о состоянии здоровья человека.

5. Иметь представления о методах профилактики нарушений биохимического равновесия в крови.

Учащийся должен уметь:

1. Работать с химической посудой, пипетками, дозатором и др.

2. Работать на спектрофотометре.

3. Приготовить необходимые рабочие реагенты.

4. Провести биохимическое исследование по предложенной методике.

5. Дать начальную интерпретацию полученному результату.

6. Уметь решать ситуационные задачи.

Структура занятия.

1. Теоретическая часть:

1. Повторение теоретического материала по теме «Химия крови».

2. Вводное слово преподавателя.

Билирубин образуется в организме в результате естественного распада гемоглобина эритроцитов в клетках РЭС (печень, селезёнка). Билирубин относится к группе желчных пигментов и является токсичным веществом. Он обезвреживается в клетках печени. К месту обезвреживания билирубин транспортируется в комплексе с белком – альбумином (свободный билирубин). В печени происходит процесс обезвреживания по схеме:

глюкуронилтрансфераза

билирубин + УДФ-глюкуроновая кислота билирубин (моно- и диглюкуронид)

Глюкурониды билирубина хорошо растворимы. Они выводятся из печени по желчевыводящим путям.

В сыворотке крови содержится два вида билирубина: нерастворимый (в виде комплекса с белками, обеспечивающими транспорт) и растворимый (диглюкуронид). Вместе обе формы составляют общий билирубин. Определение содержания билирубина в крови является важным диагностическим тестом. Билирубин обычно содержится в крови в небольших количествах – 0,5-1,2 мг-%. Из него 75% приходится на долю свободного билирубина (нерастворимого, связанного с белком).

2. Указания к занятию. Методические рекомендации:

   1. Внимательно изучите инструкцию.

   2. Приготовьте всё необходимое для проведения анализа.

   3. Осмыслите ход выполнения лабораторной работы.

   4. В работе используйте параллельные пробы с целью самоконтроля за качеством работы.

   5. Соблюдайте меры предосторожности в работе с реактивами, био-логическим материалом, на спектрофотометре.

   6. При работе с градуированной пипеткой используйте резиновую грушу с передником.

   7. Соблюдайте дезинфекционный режим в работе.

Практическая часть.

1. Приготовление рабочих растворов.

Опыт 1. Приготовление калибратора.

Выполнение опыта:

Внести во флакон с калибратором 2,0 мл дистиллированной воды. После полного растворения концентрация билирубина – 85,5 мкмоль/л. Данный раствор стабилен в течение 5 дней при температуре 2-8°C. Реагент хранить в темноте!

Опыт 2. Приготовление диазореагента.

Выполнение опыта:

Смешать растворы сульфаниловой кислоты и нитрита натрия в соотношении 10:1. Диазореагент стабилен не менее 10 дней при температуре хранения 2-8°C в плотно закрытом флаконе в темноте.

2. Лабораторная работа: «Определение количества билирубина в сыворотке крови по методу Йендрашина».

ПРИНЦИП: В результате реакции между билирубином и диазотированной сульфаниловой кислотой образуется окрашенный комплекс (розово-фиолетовый), имеющий максимум поглощения при длине волны 540 нм. Для определения общего билирубина необходима диссоциация неконъюгированного (непрямого, свободного) билирубина, что достигается введением в реакционную смесь кофеина. При определении содержания конъюгированного (прямого, связанного) билирубина кофеин из реакционной смеси исключается.

Концентрация неконъюгированного билирубина рассчитывается по разнице концентрации между общим и конъюгированным билирубином.

Оборудование: штатив с пробирками, штатив с пипетками, пипетки градуированные (1мл и 2 мл), микропипетки (0,2 мл); спектрофотометр.

Реактивы: набор реагентов «Абрис+» для определения концентрации билирубина в сыворотке крови; дезинфицирующий раствор – 0,5% раствор Полидеза; физиологический раствор.

Материал для исследования: сыворотка крови.