Ход определения.

В центрифужную пробирку вносят 1,0 мл сыворотки (или мочи) и 0,5 мл ТХУ. После перемешивания содержимого производят центрифугирование при 3000 об/мин. в течение 30 мин. Отбирают 0,5 мл надосадочной жидкости и переносят в пробирку с 4,5 мл дистиллированной воды. Содержимое пробирки перемешивают и фотометрируют при длине волны 254 нм, используя в качестве контрольной пробы дистиллированную воду.

Результаты выражают в условных единицах, представляющих собой показатели оптической плотности, учтённые с точностью до третьего знака после запятой.

Референтные пределы: уровень среднемолекулярных пептидов в пробах сыворотки крови – 0,240 ± 0,02 ед., в пробах мочи – 0,319 ± 0,15 ед.

Примечание: При исследовании мочи рекомендуется разводить субстрат дважды, т.е. из 5 мл первоначально поученного раствора отбирать 0,5 мл с последующим внесением этого объёма к 4,5 мл дистиллированной воды.

б) Модифицированный способ определения веществ группы средних молекул в биологических жидкостях.

ПРИНЦИП: Метод основан на осаждении высокомолекулярных белков плазмы крови действием хлорной кислоты и этилового спирта с последующей фотометрией при длине волны 210 нм.

Реактивы: 1,2 моль/л раствора хлорной кислоты (13,8 мл хлорной кислоты х.ч. довести дистиллированной водой до 100 мл); 2 моль/л раствора калия углекислого; 96% раствор этилового спирта.

Оборудование: центрифуга; спектрофотометр (позволяющий выделить длину волны 210 нм); пробирки; пробирки центрифужные; штатив; пипетки; ледяная баня.

Материал для исследования: плазма или сыворотка крови.

Ход определения.

В центрифужную пробирку помещают 0,5 мл плазмы (сыворотки) крови, добавляют 0,5 мл хлорной кислоты (реактив I), тщательно перемешивают встряхиванием, оставляют при комнатной температуре на 10-15 мин., затем центрифугируют при 3000 об/мин. в течение 10-15 мин. Отбирают 0,5 мл центрифугата в пробирку, в которую добавляют 0,1 мл раствора углекислого калия (реактив II). Пробирку выдерживают в ледяной бане в течение 20 мин.

Пробу центрифугируют при 3000 об/мин. в течение 10-15 мин. Отбирают 0,2 мл надосадочной жидкости в центрифужную пробирку, добавляют 0,8 мл этанола, встряхивают, оставляют на 10 мин. при комнатной температуре, затем центрифугируют 10 мин. при 3000 об/мин. (для осаждения высокомолекулярных примесей). Отбирают 0,5 мл центрифугата и добавляют 4,5 мл дистиллированной воды. Перемешивают. Фотометрируют при длине волны 210 нм относительно контрольной пробы.

К о н т р о л ь н а я п р о б а: 0,2 мл дистиллированной воды и 0,8 мл этилового спирта; отбирают 0,5 мл этого раствора и добавляют 4,5 мл дистиллированной воды.

Расчёт: Показатель оптической плотности пробы при длине волны 210 нм умножают на 3,94 – коэффициент пересчёта результата (в г/л) с учётом разведения биологической жидкости.

Референтные пределы: концентрация средних молекул в плазме крови у практически здоровых взрослых людей – 0,53 ± 0,02 г/л.

4. Закрепление знаний, умений и навыков.

4.1. Выполнение лабораторной работы.

4.2. Учёт результатов.