Автоматизация проточной цитометрии

Этот метод должен сохраняться на вооружении в любой лаборатории, выполняющей гематологиче­ские исследования, поскольку является «золотым стандартом».

Преимущества современных проточных анализаторов для под­счета и оценки форменных элементов крови состоят в следующем: высокая производительность (до 100—120 проб крови в час); мик­роанализ (объем пробы — 12—150 мкл крови); анализ большого массива (десятки тысяч) клеток; высокая точность (правильность и воспроизводимость); большое количество одновременно опре­деляемых и рассчитываемых параметров (более 20); графическое представление результатов исследований (гистограммы, скето-граммы).

Технология автоматического подсчета клеток была разработа­на в 1947 г. братьями Култер. Метод получил название апертуро-импедансного (или метод электрического импеданса, кондукто-метрический метод, метод Култер).

Принцип метода. Метод основан на подсчете числа и определе­нии характера импульсов, возникающих при прохождении клеток через отверстие малого диаметра (апертуру) в узкой капил­лярной трубке диаметром порядка 100 мкм, по обе стороны от которой расположены изолированные друг от друга электроды сети постоянного тока. Если через этот узкий канал, заполненный элек­тропроводящим раствором, проходит клетка крови, то в этот мо­мент сопротивление электрическому току в канале слегка возра­стает (рис. 11.2), это изменение улавливают современные элект­ронные приборы. Таким образом, каждый случай прохождения клетки через канал сопровождается появлением электрического импульса, и для того чтобы подсчитать концентрацию клеток, необходимо пропустить через него определенный объем суспен­зии клеток в электропроводящем растворе и сосчитать число элек­трических импульсов, которые при этом образуются.

Если в канале одномоментно находятся две клетки, то образу­ется один импульс, и это приведет к ошибке подсчета клеток. Для исключения этих ошибок пробу крови разводят до такой концен­трации клеток, при которой в канале датчика всегда будет не бо­лее одной клетки. При характерном диаметре канала 80 мкм и его длине 100 мкм, объем измерительного канала получается 0,5 мм³. В этом случае, чтобы уменьшить концентрацию клеток крови до нужной величины, необходимо выполнить разведение крови в 25 000 раз.

Задача разделения эритроцитов и тромбоцитов в проточных анализаторах решается путем измерения амплитуды (высоты) элек­трического сигнала. Тромбоциты — клетки, меньшие по разме­рам, чем эритроциты, они образуют импульсы низкой амплиту­ды, а сравнительно большие по размерам эритроциты дают им­пульсы высокой амплитуды. Устройство, разделяющее импульсы по величине амплитуды, называется дискриминатором. В совре­менных гематологических анализаторах встроены многоканальные дискриминаторы. Поскольку каждый канал соответствует опреде­ленному объему клеток (рис. 11.3), они дают детальную информа­цию о размерах клеток в виде гистограмм (рис. 11.4).

После выделения на гистограмме зоны объемов клеток, соот­ветствующих эритроцитам, и после суммирования данных, заре­гистрированных по всем каналам дискриминатора, получают об­щее количество эритроцитов (они в современных анализаторах обозначаются аббревиатурой RBC (от англ. red blood cells)), про­шедших через датчик. При суммировании результатов подсчета эритроцитов, полученное в каждом канале значение умножают на объем соответствующего канала, в результате автоматически вычисляют объем, который занимают эритроциты в крови, т.е. значение гематокрита НСТ. При делении величины гематокрита на концентрацию эритроцитов получают характеристику эритроци­тов — средний корпускулярный объем (mean corpuscular volume — MCV). Этот показатель используют также для расчета коэффици­ента вариации объема эритроцитов и обозначают как RDW (red cell distribution width). Он является показателем гетерогенности эритроцитов по объему, характеризует степень анизоцитоза. Ана­логичным образом измеряют концентрацию тромбоцитов — PLT(platelet), тромбокрит — РСТ (platelet crit), средний объем тромбоцитов (mean platelet volume — MPV), ширину распределе­ния тромбоцитов по объему (platelet distribution width — PDW), рассчитывают как коэффициент вариации тромбоцитометрической кривой. Этот показатель количественно отражает гетерогенность популяции тромбоцитов по объему, т. е. степень анизоцитоза тром­боцитов.

В отличие от ручного подсчета тромбоцитов, при котором про­водят предварительный лизис эритроцитов, в проточных гемоци-тометрах подсчет эритроцитов и тромбоцитов выполняют в одной камере без предварительной обработки крови. При этом возника­ют проблемы дифференцировки больших форм тромбоцитов (макротромбоцитов) и сравнимых с ними по объему эритроцитов (микроцитов), их фрагментов (шизоцитов), а также отшнуровав-шихся фрагментов цитоплазмы лейкоцитов (клеточный дебрис).

Для предупреждения подсчета одних элементов вместо других в кондуктометрических счетчиках анализируется не только амп­литуда электрического импульса, но и его форма. Встроенные дискриминаторы определяют высоту электрического сигнала, пропорциональную размеру частицы, и ширину (длительность) импульсов. Таким образом, все импульсы, соответствующие раз­мерам частиц от 1,8 до 30,0 фл, подсчитываются как тромбоциты. Если амплитуда импульса превышает соответствующую размерам 30 фл, появляется сообщение «Micro RBC», либо «Масго PLT», при этом происходит автоматическая коррекция количества тром­боцитов и выдается истинный результат.

Поскольку размеры эритроцитов и лейкоцитов близки, разде­лить их по величине амплитуды электрического импульса невоз­можно. Поэтому лейкоциты вносят некоторый вклад в подсчет эритроцитов. Но вклад этот, за исключением явных лейкоцито­зов, ничтожно мал, им можно пренебречь, так как в норме кон­центрация эритроцитов в крови на три порядка выше концентра­ции лейкоцитов. Для раздельного определения концентрации лей­коцитов (white blood cells — WBC) и эритроцитов в крови ис­пользуют различие свойств мембран этих клеток к действию ге-молитиков.

Эритроциты легко лизируются под действием поверхностно-активных веществ. Претерпевающие при этом некоторые измене­ния лейкоциты остаются целыми и могут быть подсчитаны. По­этому перед подсчетом лейкоцитов в кондуктометрических счет­чиках, прежде, чем пропустить кровь через апертуру датчика, к ней добавляют раствор, лизирующий эритроциты. Мелкие фраг­менты, до которых разрушаются эритроциты, дают электриче­ские импульсы очень низкой амплитуды и не мешают определе­нию лейкоцитов.

Во всех современных проточных цитометрах есть возможность для определения концентрации гемоглобина с помощью встро­енных в них гемоглобинометров. Поэтому кроме определения кон­центрации гемоглобина НЬ, имеется возможность рассчитать сред­нее содержание гемоглобина в эритроците (mean corpuscular hemoglobin — МСН) в пикограммах, которое очень важно знать при разделении анемий на нормохромные, гипо- и гиперхром-ные. Среднее содержание гемоглобина является более объектив­ным показателем, чем цветной показатель, не отражающий синтез гемоглобина в эритроците и его содержание в нем. Метод позво­ляет рассчитать также среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците (mean corpuscular hemoglobin concentration — MCHC), которая отражает истинное насыщение эритроцита гемоглоби­ном.

Получаемую в результате проточной цитометрии информацию можно разделить на две основные группы — параметры непосред­ственно измеряемые на этих анализаторах, например RBC, PLT, WBC, НЬ, и расчетные параметры, такие, как MCV, МСН, MCHC, РСТ, PCV, PCD и др.

Гистограммы распределения отдельных типов клеток крови по размерам, которые также выдаются при этом автоматическом ана­лизе, как и возможность получения новых параметров, по срав­нению с ручными визуальными измерениями избавили специа­листов лабораторий от необходимости использовать трудоемкие методы.

С помощью автоматических счетчиков клеток крови можно не только оценить размеры клеток, но и получить цитохимические и другие характеристики клеток крови. Они анализируют около 10 ООО клеток в одном образце и имеют несколько различных ка­налов для подсчета клеток и определения гемоглобина.

Современные цитометры наряду с кондуктометрическим ме­тодом могут быть оснащены устройствами для оценки рассеяния света лазера, что дает возможность строить скетограммы, т. е. ди­аграммы распределения клеток по их способности рассеивать свет лазера. Это позволяет более четко выделять различные группы кле­точных элементов, отличающиеся не только по размеру, но и по зернистости.

Технологии автоматизированной цитометрии. Можно выделить несколько типов технологий для дифференциального подсчета клеток, лейкоцитов и лейкоцитарной формулы, реализованных в высокотехнологичных гематологических анализаторах.

Радиочастотный анализ. При прохождении клеткой апертурно-го отверстия в токе высокой частоты возникают сигналы, кото­рые отражают характер внутренней структуры клетки.

Технология пероксидазного канала. Это проточная цитохимичес­кая технология, позволяющая дифференцировать лейкоциты на основе различной активности пероксидазы в них. Активность это­го фермента наиболее выражена в эозинофилах и нейтрофилах, слабую реакцию дают моноциты, в лимфоцитах она не выявляет­ся. При этом измеряется рассеяние клетками света от луча лазера (так определяется размер клеток) и поглощение клеткой света (оценка активности пероксидазы в клетке).

Технология VCS — трехмерный анализ дифференциации лейкоци­тов. Технология основана на одновременном компьютерном ана­лизе клеток по трем направлениям: объем (volume), электропро­водность (conductivity), дисперсия лазерного света (laser scatter). Полученные по трем каналам данные комбинируются и анализи­руются с помощью компьютера, в результате происходит распре­деление клеток по дифференцировочным кластерам, и, таким образом, лейкоциты разделяются на пять основных популяций: лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы.

Технология MAPSS— изменение дисперсии лазерного света клет­ками. Это многоугловая система лазерного светорассеяния, или поляризация многоуглового светорассеяния, т. е. регистрация ин­тенсивности светорассеяния клетками поляризованного лазерно­го луча под разными углами. Технология компьютерного анализа дисперсии лазерного света клетками крови применена в гемато­логических автоанализаторах фирмы «Abbott» для дифференциа­ции эозинофилов и базофилов. С помощью этой технологии могут быть получены сведения о различных свойствах клеток и в резуль­тате на гематологических анализаторах строятся скетограммы лей­коцитов крови.

Технология с использованием специфического химического лизиса лейкоцитов. Технология основана на предварительной обработке лейкоцитов реактивами, вызывающими дифференцированный лизис всех клеток, за исключением лейкоцитов определенной популяции (эозинофилов или базофилов). Затем проводят диск-риминантный анализ всех клеток по размеру и сложности струк­туры.

Измерение флюоресценции красителей, связанных с избиратель­ными клеточными структурами. Технология лежит в основе про­точной цитофлюориметрии. Наибольшее применение в цитофлюо-риметрии нашли методики распределения клеток по содержанию ДНК и флюоресцентные метки клеток антителами (иммунофено-типирование), которые можно применить одновременно на од­ном образце.

В проточных цитометрах флюоресценция имеет несколько пре­имуществ: флюоресцентное излучение прямо пропорционально специфическим клеточным компонентам, концентрация флюо-рохромов, используемых для исследования клетки, очень низкая, нефлюоресцирующие соединения могут становиться флюоресци­рующими при взаимодействии с внутриклеточными структурами или ферментами.