Автоматизация иммунохимических исследований

Автоматизация иммунохимических исследований осуществля­ется как в форме полуавтоматических систем, перенос проб меж­ду которыми проводят вручную, так и в полностью автоматиче­ском варианте. В зависимости от варианта технологии — конку­рентное или неконкурентное связывание, метод одинарных или двойных антител, микроточечное иммуноисследование или мик­роточечный зонд — в состав блоков автоматического анализатора должны входить следующие устройства: распределения проб био­материала; дозирования связывающего агента (если он заранеее не закреплен в реакционной емкости — пробирке, лунках план­шета); процессов отмывания.

Для детекции радиоактивной метки в радиоиммунологических и иммунорадиометрических методах используют сцинтилляцион-ные счетчики, в иммуноферментных методах — фотометры, в иммунофлюоресцентных методах — флюорометры, в иммунохе-милюминесцентных — люминометры. При использовании план­шетов детекцию и измерение результата можно выполнять с по­мощью вертикальной фотометрии.

Программы компьютерной обработки данных в этих приборах особенно сложны, так как должны учитывать большое число фак­торов и использовать калибровочную кривую Гейдельбергера— Кендалла.

Для выполнения иммунохимических исследований в лаборато­риях различной мощности можно использовать семейство анали­заторов ES 33, ES 300, ES 700, позволяющих определять до 40 различных параметров, относящихся к сферам интересов ин-фектологии, эндокринологии, кардиологии, онкологии, аллер­гологии, акушерства. Специализированной системой для автома­тизированного аллергологического иммуноанализа является «UniCAP 100» (Швеция).

В случае автоматизированного иммуноферментного анализа используют предназначенные для этих исследований автоанали­заторы, например автоматизированную систему «OMNI» (США) для такого анализа в планшетах, представляющую собой полно­стью «открытый» (можно использовать наборы реактивов различ­ных изготовителей) автоанализатор производительностью 5 план­шетов в час. Одновременно можно загрузить 17 планшетов и вы­полнить анализы по 12 методикам.

Автоматизированная система «Alpha» для планшетного анали­за этой же фирмы тоже является полностью «открытой» систе­мой, в которой анализ можно выполнить по 18 методикам, одно­временно до 8 аналитов в одной пробе. На борту автоанализатора есть холодильник для хранения конъюгатов, субстратов, конт­рольных материалов и калибраторов, а наличие двух отсеков для инкубации позволяет одновременно выполнять методики, требу­ющие различной температуры инкубации. Приготовление разве­дений проб, реагентов, смешивание субстратов выполняются ав­томатически без вмешательства лаборанта.

Роботизированная рабочая станция «GENESIS RMP» (Швей­цария) представляет собой полностью автоматизированную плат­форму для подготовки проб и проведения иммуноферментного анализа в планшетах. Она рассчитана на работу в клинико-диаг­ностических лабораториях больниц, где требуется широкий спектр тестов в условиях относительно невысокой загруженности; в бан­ках крови, где в условиях короткого времени необходимо выпол­нить ограниченный и постоянный спектр тестов; референсных лабораториях, где нужны большие объемы анализов и высокая производительность. Система является открытой. Все стадии им­муноферментного анализа с ее помощью выполняются без учас­тия человека, а внутреннее пространство аппарата изолировано от окружающей среды. Обслуживание прибора сводится к загрузке оператором расходных материалов и исследуемых образцов.

Автоматическим иммуноферментным анализатором для рабо­ты с микропланшетами является система «WAAMC-2» (Франция). В основе ее конструкции использована «механическая рука» — высокоточный трехкоординатный робот. Система состоит из 1 — 4 технологических модулей, каждый из которых включает ав-тосамплер, дилютор-диспенсер, шейкер-инкубатор, промыватель, считыватель, робот-манипулятор, систему питания. Поскольку си­стема «WAAMC-2» предназначена для выявления ВИЧ-инфекции, в ее конструкции особое внимание уделено безопасности для пер­сонала. Каждый модуль выполнен в виде стойки с защитным про­зрачным кожухом, исключающим контакт оператора с биологи­ческим материалом. Все технологические операции выполняются в закрытом изолированном пространстве, использование однора­зовых наконечников исключает возможность «переноса».

В иммунохемилюминесцентном автоанализаторе «Access» ис­пользуется метод непрямой хемилюминесценции с парамагнит­ными частицами в качестве твердой фазы (при производительно­сти 100 тестов в час). Одномоментная загрузка прибора — 6 шта­тивов (по 10 образцов каждый) любого перечня тестов из 24 име­ющихся в приборе наборов реагентов, а всего с помощью прибо­pa «Access» можно выполнить 49 лабораторных тестов, применяе­мых при эндокринной, сердечно-сосудистой, онкологической, гематологической, аллергологической, инфекционной патологии и лекарственном мониторинге.

Автоматизированная система иммуноферментного анализа «А1А-21» (США, Япония и Бельгия) представляет собой анали­затор нового поколения для лигандной технологии («сэндвич» ана­лиз одно- и двустадийный, конкурентный одностадийный имму-ноанализ) и с использованием сухих реактивов, фиксированных на магнитных носителях, помещенных в изолированные пласти­ковые капсулы с конъюгатом. Пробу, разбавитель и в некоторых случаях конъюгат добавляют в капсулу после ее прокалывания зондом и перемешивания. Детекцию результатов реакции прово­дят в этой же капсуле по кинетике образования флюоресцентной метки методом двухволновой флюорометрии. Имеется режим для срочных анализов — STAT-режим, производительность автоана­лизатора — 120 анализов в час.

Высокие аналитические возможности иммунохемилюминесцен-ции реализованы также в автоматическом анализаторе свободно­го доступа «IMMULITE» (США), использующем не микроплан­шеты, а пробирки (тест-ячейки) в качестве реакционных емко­стей. Он широко распространен в клинико-диагностических лабо­раториях нашей страны, хотя и относится к «закрытым» системам (реактивы только изготовителя анализатора).

На рис. 9.1 представлена схема процесса определения в этом приборе. Проба и реагент автоматически дозируются в тест-ячей­ку для анализа, которая содержит покрытый специфическими антителами шарик (рис. 9.1, а). Далее ячейку инкубируют при тем­пературе 37 °С и постоянном встряхивании. После инкубации тест-ячейку подвергают высокоскоростному центрифугированию в ана­лизаторе вокруг вертикальной оси (рис. 9.1, б). Реакционная жид­кость отсасывается в специальную камеру. В процессе нескольких промываний с поверхности шарика и внутренней поверхности пробирки удаляется весь несвязавшийся материал (рис. 9.1, в). За­тем в ячейку добавляется хемилюминесцентный субстрат. Свет люминесценции измеряется высокочувствительным счетчиком фотонов (рис. 9.1, г).

Хотя производство микрочипных аналитических систем нахо­дится еще на ранней стадии развития, тем не менее уже имеются комбинации камеры для иммуноанализа с устройством для ка­пиллярного электрофореза. Осуществляется стыковка нескольких индивидуальных микрочипов, предназначенных для отдельных аналитических процедур, в единый комплекс, представляющий собой многоканальную аналитическую систему, способную од­номоментно выполнять несколько видов исследований из одной пробы биоматериала. Примером может служить многоцелевой ана­лизатор «EVIDENCE», позволяющий одномоментно из одной капли крови определять до 25 аналитов на одном биочипе. При этом упрощается работа, повышается производительность, сокра­щается общая стоимость теста.

АВТОМАТИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ СВЕРТЫВАЮЩЕЙ И ПРОТИВОСВЕРТЫВАЮЩЕЙ СИСТЕМ КРОВИ

В этих приборах используются все виды аналитических техно­логий, известных в коагулологии: клоттинговые, хромогенные и иммунохимические.

Клоттинговые технологии основаны на образовании в ходе ис­следования аналита сгустка фибрина и регистрации механически­ми, оптическими или оптико-механическими методами начала или окончания времени его образования. Так определяется актив­ность исследуемого фактора свертывающей или противосверты-вающей систем в каскаде процесса образования сгустка или его лизиса.

Методы с использованием хромогенных субстратов основаны на способности факторов свертывания проявлять ферментативные свойства сериновых протеаз. Такими свойствами обладает тром­бин, образующийся в ходе реакций определения протромбиново-го времени, протеин С и др. В ходе анализа образующийся тром­бин (или другая сериновая протеаза) вызывает гидролиз хромо-генного субстрата в месте присоединения к полипептидной цепи окрашенного соединения, например, 4-нитроанилина. В результа­те не имеющий окраски субстрат (тосилглицилпролиларгинил-4-нитроанилид) отдает в реакционную смесь отсоединившийся от него 4-нитроанилин и раствор приобретает зеленовато-желтый цвет, светопоглощение которого измеряется фотометрически — кинетически или путем измерения фиксированной абсорбции. Учитывая, что при этом параллельно вследствие образования тром­бина (например, при определении протромбинового времени с хромогенными субстратами) фибриноген превращается в фибрин, вызывающий помутнение раствора, при специальном програм­мировании коагулологических анализаторов в рамках определе­ния одного показателя, в данном случае протромбинового време­ни, можно определять и концентрацию фибриногена.

Иммунохимические методы на основе реакции преципитации комплекса «антиген —антитело» с использованием антител (на­пример, в случае Д-димера), иммобилизованных на латексных частицах или путем иммуноферментного анализа позволяют определять факторы свертывающей и противосвертывающей сис­тем так, как определяют различные белки, антигены. В первом случае для детекции используют лазерную нефелометрию, во вто­ром — фотометры и фотометрические ридеры для иммунофер-ментного анализа.

Соответственно в конструкции автоматических коагулологиче-ских анализаторов должны быть представлены устройства или блоки для реализации этих технологий: устройства для вращения шари­ков в тестовых пробирках и детекторы, регистрирующие время прекращения этого вращения в результате образования сгустка крови; дозаторы для добавления хромогенных реагентов и фото­метрические детекторы; комплекс устройств для иммунохимиче-ского исследования. Примером такого прибора может служить «STA Compact* (Швейцария), способный реализовать до 80 програм­мируемых тестов системы свертывания, включая протромбиновое время, факторы внешнего пути активации (II, V, VII, X), факто­ры внутреннего пути активации (VIII, IX, XI, XII), фибриноген и др. Производительность прибора — до 150 тестов в час, может быть выполнено до 12 методов на одну пробу. До 1 ООО анализов выполняются в режиме walk away, т. е. без присутствия оператора после запуска прибора в работу.

Механический способ детекции образования сгустка путем ре­гистрации изменения (снижения вследствие повышения вязкости пробы) амплитуды колебаний стального шарика, находящегося в магнитном поле, в кювете на полукруглом ее дне обеспечивает независимость результатов от окраски и оптических свойств про­бы плазмы, в частности до концентрации гемоглобина в ней 20 г/л.

Сосуды с реактивами охлаждаются в штативе для них и про­греваются в специальных позициях до требуемой температуры 37 "С. Кюветы для выполнения и измерения продукта реакции загружа­ют в рулонах по 1 ООО шт. по аналогии заправки фотопленки в фотоаппарат, а по окончании использования их сбрасывают в опе­чатанный контейнер для обеспечения максимума безопасности и исключения контакта с оператором. Свыше 14000 результатов мо­жет храниться в памяти прибора. Имеются встроенные програм­мы контроля качества с представлением статистических данных за любой период времени (день, месяц, год).

В семействе коагулологических анализаторов «Thrombolyser Compact*, «Thrombolyser Rack Rotor», «Thrombolyser Combi» (Гер­мания) применяется единая технология с использованием общей кюветы, куда дозируются проба и реагенты и где они одновре­менно инкубируются, не смешиваясь, после чего при помеще­нии в измерительный блок и перевороте кюветы на 90° происхо­дит их смешивание до гомогенной смеси с помощью стального шарика (рис. 10.1). Связывание шарика с нитями фибрина позво­ляет точно документировать время образования сгустка. Описан­ные анализаторы относятся к автоматам дискретного типа.

С помощью центрифужных анализаторов семейства «ACL 100 — 7000» (США) автоматизированные коагулологические исследова­ния выполняют в секторах роторов. Каждый из секторов заканчи­вается измерительной кюветой. В случае измерения мутности ис­пользуется нефелометрический способ измерения рассеяния света луча лазера частицами под углом 90° к направлению падающего света. Другой принцип измерения в этих анализаторах — фотомет­рический — для методов с хромогенными субстратами. Автоана­лизаторы для наиболее трудно автоматизируемых коагулологиче­ских исследований — агрегации тромбоцитов (анализаторы «Trombostat 4000» и их последующие варианты — «PFA-100», США) позволяют не только выявлять дефекты функции тромбо­цитов, но и отслеживать эффекты лечения, например, ацетилса­лициловой кислотой. Кроме того, на них в течение 10 мин опре­деляется и время кровотечения.

Эти приборы контролируются микропроцессорами. Реакция для каждого теста проходит в специальном картридже, компонента­ми которого являются чашка с так называемой капиллярной ас­самблеей, которая вставляется в специальный кожух — резервуар для пробы. Цельная кровь с антикоагулянтом (цитрат) пипетиру-ется в отверстие для ввода пробы.

После инкубации чашка, соединенная с капилляром, пере­двигается вниз внутрь кожуха, капилляр из нержавеющей стали пробивает мембрану, покрывающую пробу. Кровь движется вверх по капилляру и приходит в контакт с мембраной, покрытой кол­лагеном, адреналином, барбитуратами или АДФ. Эти вещества стимулируют тромбоциты к прилипанию и агрегации на мем­бране.

Таким образом, путем автоматизации коагулологических ис­следований, появляется возможность не только упростить техно­логию (как, например, в случае определения фибриногена в плаз­ме) по сравнению с ручным методом, не только ускорить выпол­нение анализа и увеличить производительность труда, но и стан­дартизовать методы, значительно улучшить качество, повысить надежность результатов.