Автоматизация биохимических исследований

По степени участия в аналитическом процессе человека сред­ства лабораторного анализа подразделяют на несколько групп: для ручных методов, в которых все аналитические процедуры выполняют вручную; механизированных методов, в которых от­дельные этапы аналитических процедур (например, этап дози­рования проб и реагентов, этап измерения оптической плотно­сти и др.) могут оснащаться узкоцелевыми автоматизированны­ми устройствами, и, перенося пробы последовательно от одного устройства к другому, лабораторный работник объединяет эти устройства в полуавтоматическую аналитическую систему; пол­ностью автоматизированных методов.

В полностью автоматизированной системе — автоанализа­торе — исследуемая проба перемещается по непрерывному пути, подобному производственному конвейеру, вдоль ряда автомати­зированных устройств, выполняющих свой этап анализа и пред­ставляющих собой блоки единого аналитического прибора. При работе с такими приборами человек выполняет функцию управ­ления.

Первые автоанализаторы были созданы в 1950-е гг., когда прак­тически параллельно были выдвинуты идеи автоматизации лабо­раторных тестов путем измерения аналитов в потоке исследуемой биожидкости: для гематологических исследований на основе про­точного кондуктометрического метода цитометрии, т.е. подсчета числа клеток крови и измерения их объема, а для биохимических исследований — путем последовательного анализа проб биомате­риала в постоянном потоке жидкости, представляющей смесь пробы с реагентами в системе капиллярных трубок.

Если в дальнейшем развитии производства гематологических автоматических анализаторов кондуктометрический принцип (хотя и дополненный некоторыми другими способами измерения свойств клеточных элементов) сохранился как основной до настоящего времени, конструирование биохимических анализаторов развива­лось и по другим направлениям.

Концепция проточного биохимического анализатора была реа­лизована не только в одноканальном варианте, где пробы анали­зировались лишь в отношении одного компонента, но и в виде многоканальных (2-, 6-, 12-канальных) последовательных, про­точных автоматических анализаторов, позволявших исследовать одну и ту же пробу параллельно по нескольким параметрам.

В дискретных анализаторах, в которых каждую пробу помеща­ют в отдельную емкость, куда затем поступают необходимые для реакции реагенты (рис. 8.1), указанная концепция была реализо­вана во многих вариантах, и стала основной в действующем парке лабораторных автоматических анализаторов.

Принципиальная схема устройства автоматического биохими­ческого анализатора дискретного типа:

/ — пробоподготовка; 2 — перенос пробы в реакционные сосуды и добавление реагента 1; 3 — добавление реагента 2; 4 — смешивание; 5 — инкубирование; б — добавление реактива 3; 7 — перенос пробы для измерения в кювету фотометра; 8 — фотометрия; 9 — расчет и распечатка результатов

Концепция центрифужного анализатора совместила в себе по­следовательность, дискретность и параллельность анализа одно­временно, поскольку в отдельные радиальные бороздки диска ро­тора одновременно вносились пробы, реагенты для выполнения одного и того же анализа, проводившегося параллельно в процес­се вращения ротора.

Важным свойством многих современных автоматических ана­лизаторов является селективность, т. е. способность выполнять для каждой исследуемой пробы те анализы, которые введены соот­ветствующей командой, а также возможность выполнения вне очереди экстренно необходимых исследований (свободный дос­туп).

Отдельные блоки автоматизированных аналитических систем для клинико-биохимических исследований выполняют следующие операции:

1. идентификация образца биоматериала;

2. обработка образца;

3. перенос образца и его распределение;

4. удаление белка и других интерферентов;

5. отмеривание пробы, ее перенос и распределение;

6. хранение реагентов;

7. отмеривание реагентов, их распределение;

8. фаза химической реакции;

9. измерение результата реакции;

10) обработка сигнала и хранение данных.

Идентификация образца биоматериала необходима для безус­ловного опознания его на всех этапах аналитического процесса и отнесения полученного результата анализа к обследуемому паци­енту. Каждому образцу присваивается порядковый номер, кото­рый кодируется тем или иным образом, принятым в данной лабо­ратории. Этот код должен быть нанесен на пробирку с образцом.

Наиболее распространен штриховой код. Определенные соче­тания штриховых линий соответствуют порядковым номерам об­разцов. Метки со штрих-кодами можно заготавливать заранее и присваивать образцам по мере поступления их в лабораторию. Наряду с этим существует возможность изготовления меток с по­мощью ручных печатающих устройств непосредственно в месте взятия материала у пациента.

Штрих-кодами могут маркироваться упаковки реагентов, ис­пользуемых в аналитическом процессе. Заложенная в них инфор­мация считывается предназначенными для этого устройствами («световыми карандашами», лазерными штрих-ридерами).

В настоящее время существует несколько систем штрих-кодов, и поэтому необходимо удостовериться в соответствии возможно­стей ридера по отношению к штрих-коду, используемому произ­водителем маркированных пробирок и упаковок реагентов. Среди вариантов способов идентификации — пробирки с колпачками разного цвета для дифференциации различных видов образцов (с гепарином, теми или иными консервантами), код образца мо­жет быть нанесен на колпачок; контейнеры с кодами, нанесен­ными непосредственно на стенку пробирки; недавно предложен­ный «матричный код», который позволяет уплотнить закодиро­ванную информацию и может быть нанесен на различные части контейнера с образцом; специальные держатели для пробирок с вмонтированными в них электронными запоминающими устрой­ствами, куда при взятии образца у пациента заносят всю необхо­димую информацию, включая паспортные данные, локализацию пациента в лечебном учреждении и назначенную врачом программу лабораторных исследований. Считывающие устройства для «мат­ричного кода», электронных чипов отличаются своим устройством от лазерных штрих-ридеров.

Необходимость предварительной обработки образца до начала анализа существует для аналитов, которые обычно исследуют в плазме или сыворотке крови. Автоматизация центрифугирования образцов крови непосредственно в моноблочном анализаторе за­труднительна, хотя и реализована в некоторых вариантах анали­заторов. Чаще применяют способы быстрой обработки образцов крови до их введения в анализатор. При исследованиях в цельной крови этап обработки образцов не нужен.

Детали устройств для тех или иных операций с образцами (как и на последующих этапах — с пробами биоматериалов) представ­ляют собой роботизированные аналоги приспособлений, исполь­зуемых при ручном выполнении анализов.

Поступившие в анализатор образцы в приборах некоторых кон­струкций затем подвергаются сортировке, т. е. группировке по виду исследований, которые должны быть выполнены с содержащим­ся в них материалом. Это необходимо в многопараметровых анализаторах. Для такой сортировки в конструкцию анализатора включают соответствующее устройство, обладающее способностью распознавать информацию, содержащуюся в кодах пробирок с образцами, и распределять пробирки по видам исследований. Та­кие сортирующие устройства (сортеры) могут быть как самосто­ятельным лабораторным прибором, так и одним из компонентов аналитической системы. Сортеры могут быть различной пропуск­ной способности — от нескольких десятков до тысяч пробирок в час.

Поступившие в автоматический анализатор образцы биомате­риалов перемещаются внутри прибора, чтобы оказаться в зоне действия тех или иных устройств, выполняющих процедуры, не­обходимые для обработки, дозирования и распределения проб образца. Это перемещение осуществляется за счет продвижения конвейерной цепи, кассет с пробирками или вращения диска, в отдельных ячейках или секциях которых находятся пробирки, содержащие образцы (рис. 8.2). При различных конструктивных решениях в анализаторах можно размещать от нескольких десят­ков до сотен образцов. Поскольку процесс передвижения образ­цов занимает некоторое время, для предотвращения испарения жидкости из сосудов, содержащих образцы, их закрывают кол­пачками. При достижении пробиркой с образцом зоны распреде­ления образца на отдельные порции колпачок снимается соответ­ствующим роботизированным устройством.

Из пробирки, в которой образец был доставлен в лаборато­рию, должны быть взяты порции сыворотки или плазмы для вы­полнения отдельных анализов. При этом используют пробирки небольшого объема, рассчитанные на размещение в них необхо­димого для анализа количества исследуемой жидкости и реаген­тов. Их конструкция должна способствовать минимизации так на­зываемого «мертвого» объема, т. е. избыточного количества жид­кости, нужного лишь для того, чтобы взятое для измерения результата анализа количество жидкости было не меньше требуе­мого. Эти «вторичные» пробирки могут быть многоразового пользо­вания, что требует их мытья; одноразовыми, что требует их ути­лизации после употребления; они могут формироваться непо­средственно в приборе по мере необходимости. Материал, из ко­торого изготовлены эти сосуды, не должен содержать компонен­тов, способных влиять на ход реакции.

Операции сортировки образцов, откупоривания пробирок и дозирования отдельных порций образца (аликвот) могут быть объе­динены в одном комплексе, представляющем собой самостоятель­ный прибор, готовящий пробы для нескольких анализаторов. В этом приборе поступивший в лабораторию образец биоматериа­ла идентифицируется с пациентом в соответствии со штриховым кодом, нанесенным на контейнер с образцом, с вакуумных про­бирок снимаются крышки, из образца отбирается материал для предварительной обработки.

Пробы автоматически загружаются во встроенную в прибор центрифугу с охлаждением, подвергаются центрифугированию. Проверяется объем пробы и качество биоматериала на наличие желтушной окраски, гемолиза и липемии. Автоматически кодиру­ются штриховым кодом и размещаются в пробонакопителе вто­ричные пробирки, в которые дозируется автоматическими пи­петками необходимое количество обработанной пробы из первич­ных пробирок. Пробы сортируют, т. е. собирают в кассеты по ви­дам исследований, готовят для переноса на автоанализаторы.

В зависимости от рабочей нагрузки лаборатории можно приме­нять автоматические устройства для подготовки проб различной производительности. Такие рабочие ячейки способны обработать от 300 до 1 700 первичных пробирок с пробами за один час; на борт устройства можно одновременно загрузить до 1 ООО проби­рок или 32 микропланшета. Считывающее приспособление может распознавать до 256 штрих-кодов в течение 90 с.

В тех случаях, когда зона первичной обработки образцов в поме­щении лаборатории отдалена от анализаторов, перемещение рас­сортированных и распределенных по видам исследований проб био­материалов можно проводить не только вручную, но и по стацио­нарной конвейерной линии, и с помощью специальных роботов. Следует учитывать, что для получения надежного результата проба должна находиться в контакте с электродом примерно 20 — 30 с. Этот интервал времени определяет скорость работы аналитическо­го канала, оснащенного ионоселективными электродами.

Реже в автоматических анализаторах используется кулономет-рия (система с серебряным электродом для измерения хлоридов) и кондуктометрия (система с золотым электродом для измерения азота мочевины).

Для предотвращения неблагоприятного воздействия на лабиль­ные аналиты повышенной температуры и ультрафиолетового из­лучения в приборах может быть обеспечено охлаждение образцов, размещение их в пробирках из затемненного материала и т.д.

В тех случаях, когда белки и другие интерферирующие веще­ства могут отрицательно повлиять на результаты анализов, в ана­лизаторах могут быть предусмотрены устройства для диализа био­материала через полупроницаемую мембрану или хроматографи-ческие колонки с использованием гель-фильтрации или ионооб-менников. В приборах, использующих средства «сухой химии», освобождение от интерферентов достигается за счет соответству­ющих компонентов многослойных аналитических элементов или с помощью фильтрующих мембран на диагностических полосках.

Точное дозирование порций образца, взятых для проведения определенного анализа (проб), достигается с помощью дозиру­ющих устройств типа шприцев или автоматических пипеток в при­борах дискретного типа, а в проточных анализаторах — за счет трубок со строго определенным внутренним диаметром, в кото­рые биоматериал и реагенты подаются перистальтическим насо­сом, причем пробы отделяются в этом потоке одна от другой пу­зырьками воздуха.

Скорость продвижения анализируемой жидкости должна соот­ветствовать скорости осуществления реакции, составляющей суть аналитического процесса. Пузырьки воздуха обеспечивают также уменьшение опасности взаимного загрязнения проб (переноса), очищая внутренность стенок трубки от остатков предыдущей пробы. Такую же роль играет добавление в поток жидкости поверхност­но-активного вещества — детергента.

В дискретных анализаторах дозирующие устройства должны быть не только отъюстированы в отношении дозируемых объемов про­бы и реагентов, но и точно запрограммированы на промежутки времени, необходимые для осуществления аналитических процедур в рабочем цикле прибора. Обычно в приборах, рассчитанных на один вид исследований, дозаторы имеют фиксированные объемы дозирования, тогда как в многопараметровых селективных анали­заторах дозаторы должны перенастраиваться на различные объе­мы дозирования по вводимым командам или по заданным про­граммам.

Для обеспечения непрерывности работы автоанализаторов со­ответствующими объемами реактивов, предотвращения их порчи хранение реагентов во многих из них осуществляется в холодиль­никах, встроенных в анализаторы. Наряду с соображениями со­хранности реактивов, не меньшее значение имеет и их рацио­нальное использование. Хранимая партия реактивов должна соот­ветствовать расчетной потребности в них с учетом ожидаемого количества анализов. В наибольшей степени это относится к реак­тивам короткого срока хранения. Естественно, что предпочтение оказывают системам, рассчитанным на минимальные объемы проб и, соответственно, потребляемых для их исследования реактивов.

Применение средств «сухой химии» в полностью автоматизи­рованных системах, например для биохимического исследования мочи, существенно влияет на конструкцию автоматического ана­лизатора, поскольку при этом отпадает необходимость в уст­ройствах для дозирования реактивов, их охлаждения и т. п.

Фаза химической реакции в автоматических анализаторах конст­руктивно обеспечена по-разному. Необходимое для протекания реакции перемешивание материала пробы с реактивами в про­точных анализаторах осуществляется при прохождении жидкости через спиралевидный участок трубок. При необходимости для ре­акции с более высокой температурой этот участок размещают в водяной бане с требуемым уровнем температуры, а протяжен­ность этого участка определяется скоростью протекания жидко­сти в сопоставлении с временем, необходимым для полного за­вершения реакции.

В дискретных анализаторах реакция может проходить в сосуде, в который была дозирована проба и введены растворы реактивов, либо в специальной реакционной камере.

Перемешивание пробы с реактивами осуществляется различны­ми способами: за счет быстрого впрыскивания реактивов в сосуд с пробой, путем вибрации, использования механических меша­лок, магнитного перемешивания и т. п.

Нагрев и термостатирование смеси пробы с реагентами осуще­ствляется с помощью суховоздушной или водяной бани, специ­ального нагревателя.

Оригинальное решение проблемы подачи реагентов было при­менено в автоматическом анализаторе «АСА» фирмы «DuPont», где использовались готовые наборы реагентов в таблетированной форме для отдельных видов анализов, упакованные в специаль­ные пластиковые контейнеры, выполняющие последовательно также роль реакционных сосудов, в которые вводили раствори­тель для реактивов и пробу биоматериала, и роль кювет при фото­метрическом измерении результатов реакции.

В центрифужном анализаторе смешивание пробы с реактивами и перемещение смеси от центра ротора к измерительной ячейке, расположенной на периферии, происходит в радиальных углуб­лениях ротора под действием центробежной силы при его враще­нии с переменной скоростью, а нагрев обеспечивается с помо­щью воздушной бани или электрического нагревателя, размещен­ного непосредственно на роторе.

Измерение результатов анализов можно выполнять в том же сосуде, где проходила реакция или в специальной измерительной кювете, в которую прореагировавшая смесь переносится током жидкости (проточный анализатор), при вращении (центрифуж­ный анализатор) или отбирается специальным устройством. Чаще всего используют фотометры или спектрофотометры для измере­ния светопоглощения прореагировавшей смеси, которое может сопоставляться с результатами измерения холостой пробы, с ка­либровочным материалом. В других видах исследований можно из­мерять флюоресценцию, хемилюминесценцию, поляризацию флюоресценции, светорассеяние, электрохимические характери­стики и т.д.

Для исключения интерференции различных эндогенных и эк­зогенных компонентов можно использовать бихроматическое (на двух длинах волн) и полихроматическое (на 3—16 длинах волн света) измерение поглощения света продуктами реакции. В случае применения в анализаторе средств «сухой химии» для детекции и измерения результатов используют отражательный фотометр.

При электрохимической детекции применяют чаще всего ион-селективные электроды, в некоторых случаях, сопряженные с закрепленным ферментом (определение электролитов, глюкозы, мочевины). Измерительное устройство может быть основано на применении биосенсора или микрочипа.

Обработка сигнала, поступающего от детектора, происходит в микропроцессоре или компьютере, встроенном в анализатор или сопряженном с ним. При этом в программу закладывается не только преобразование сигнала в цифровую форму, но и сложный расчет результатов с учетом данных калибровки прибора, показаний хо­лостой пробы и т.д. В современных аналитических приборах мик­ропроцессоры выполняют обширный перечень функций: текущий контроль за функционированием отдельных блоков прибора; ста­тистическую обработку результатов исследований; расчет средней арифметической, среднего квадратического отклонения, коэффи­циента вариации; распечатку контрольных карт с одновременной интерпретацией результатов; накопление данных, полученных при исследовании проб пациентов; объединение результатов различ­ных исследований, выполненных для одного пациента, и пр.