Методы / 6

МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА № 6

ТЕМА: Микробиологический метод исследования. Физиология микроорганизмов. Дыхание и его обеспечение в лабораторных условиях. Выделение чистой культуры аэробов и анаэробов.

МОТИВАЦИОННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕМЫ: Обнаружение возбудителя в материале от больного, в объектах внешней среды, пищевых продуктах – один из прямых и доказательных методов диагностики. Дыхание микробов имеет свои особенности, подходы к выделению микробов аэробов и анаэробов различны. Особенно трудна работа с анаэробами, являющимися возбудителями таких тяжелых заболеваний, как газовая гангрена, столбняк, ботулизм. Поэтому врачи любой специальности должны знать, что:

• наиболее опасны раны, загрязненные землей и инфицированные консервы;

• необходимо оберегать от загрязнения бациллами микробов-анаэробов шовный и перевязочный материал, хирургический инструментарий, качественно стерилизовать их;

• при строительстве детских игровых сооружений, открытых спортивных необходим микробиологический контроль почвы - определение степени ее обсемененности бациллами-анаэробами;

• бытовая, даже мелкая, травма у детей и взрослых, наличие раневых поверхностей, загрязненных почвой, фекальными массами - повод для:

- срочных профилактических (иногда лечебных) мероприятий,

- поисков микробов-анаэробов, выделения их чистой культуры и идентификации микробов вида.

УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ:

Общая:

• подготовить студентов к самостоятельному выделению чистой культуры возбудителя предполагаемой аэробной или анаэробной инфекции, ознакомить с общими и специфическими лечебно-профилактическими мероприятиями.

Конкретная:

• научить методам выделения чистой культуры аэробов и анаэробов (на модели почвы).

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ И ВВОДНОГО КОНТРОЛЯ ЗНАНИЙ

1. Органеллы, дыхание у микробов.

2. Сущность аэробного дыхания и его обеспечение.

3. Сущность анаэробного дыхания и особенности его определения.

4. Способы создания анаэробных условий: физические, химические, биологические.

5. Размножение и рост бактерий (особенности биосинтеза у микробов, динамика и фазы их размножения).

6. Этапы выделения чистой культуры анаэробов и особенности изучения их биологических характеристик.

7. Общность и различия схем выделения культур анаэробов и аэробов.

8. Особенности способов определения углеводолитической и протеолитической активности у микробов-анаэробов.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫЛПОНЕНИЮ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ СТУДЕНТОВ ПО ТЕМЕ С ПОЛНЫМ РЕГЛАМЕНТОМ ПРОТОКОЛА

№ п/п	Наименование учебного элемента	Методическое решение	Регламент протокола
1.	Контроль исходного уровня знаний с коррекцией	Перечень вопросов для подготовки. Рекомендуемая литература
2.	Составить схему выделения чистой культуры аэробов и анаэробов с учетом их особенностей	Приложение 1	Зарисовать в протокол
3.	Ознакомиться с методами культивирования анаэробов: -физическими -химическими -биологическими	Приложение 2 Приложение 3 Приложение 4	Зарисовать
4.	Подготовить мазок из взвеси почвы, окрасить по Граму, зарисовать		Зарисовать в протоколе в цвете
5.	Ознакомиться с особенностями определения протеолитической активности аэробов и анаэробов	Приложение 5	Внести в протокол
6.	Ознакомиться с особенностями роста анаэробов при разных способах их культивирования	Рекомендуемая литература
7.	Тестовый контроль усвоения темы	Приложение 6	Сложное записать

Приложение 1

СХЕМА ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ

Ι этап. Накопление или рассев микробного материала.

ΙΙ этап. Получение изолированной колонии.

ΙΙΙ этап. Накопление (получение) чистой культуры.

ΙΥ этап. Идентификация микробного вида.

Параметры идентификации микробного вида:

- морфология и тинкториальные свойства

- культуральные свойства

- антигенная характеристика

-биохимическая характеристика

- факторы патогенности

- фаготипирование - чувствительность к антибиотикам

Υ. Заключительный этап: на основе учета результатов, изучения морфологии, структуры, тинкториальных, культуральных, биохимических, серологических свойств, чувствительности к антибиотикам и бактериофагии дают полное заключение.

СХЕМА ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АНАЭРОБОВ

I этап. Накопление инфекционного материала.

II этап. Получение изолированной колонии.

III этап. Накопление чистой культуры.

IV этап. Идентификация микробного вида.

V этап. Заключение.

Приложение 2

ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АНАЭРОБОВ

Полужидкая среда столбиком под слоем вазелинового масла с резиновой пробкой, посев уколом.

1. Редукцией среды – удаление кислорода с кипячением и с последующим нанесением слоя вазелинового масла.

2. Микроанаэростат Аристовского.

3. Трубки Вейон – Виньяла с запаянными или парафинированными концами.

4. Эксикатор с горящей свечой.

5. Метод Перетца с заливкой инфицированной расплавленной среды между спичками на дне чашки под предметное стекло. Чашка герметически закрывается, под пластилином или парафином.

Приложение 3

ХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АНАЭРОБОВ

1. Эксикатор, на котором помещается один из поглотителей кислорода, например пирогалол. Крышка плотно притерта.

2. Пробирка Бюхнера с шаровидным расширением и шейкой внизу, куда также помещается поглотитель О₂, а над шейкой устанавливается косячок с посевом. Пробка резиновая.

Приложение 4

БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АНАЭРОБОВ (м-д Фортнера)

Метод основан на одновременном посеве в чашку со средой, разделенной по диаметру канавкой, испытуемого материала или чистой выделенной культуры анаэробов и какого-либо штамма-аэроба – жадного потребителя кислорода (Bac. Prodigiosum, Sarcina lutea – из воздуха).

Чашку с посевом герметически закрывается с помощью утрамбованной ваты, пластилина или парафина и становиться для инкубации в термостат.

Вначале в связи с присутствием в чашке О₂ бурно растут анаэробы.

Приложение 5

БИОХИМИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГАЗООБРАЗНЫХ ВЕЩЕСТВ ПРИ ОЦЕНКЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

Метод Сальковского для определения индола

Бульонную культуру микроорганизмов нагревают с 4 мл 10% серной кислоты, затем с 0,5 – 2 мл, 0,05 раствора азотисто-натриевой соли. Реактивы приливают по стенке пробирок.

Появление красно-фиолетового кольца указывает на наличие индола.

Определение индола по методу Эрлиха

Культуру выращивают на МПА, после чего делают густой посев в пробирки жидкой средой с казеином, нагретой до 30-35С⁰.

Пробирки инкубируют 2 часа в термостате, а затем добавляют сначала 5 мл раствора №1, а затем 5 мл раствора №2. Через 5 минут, при наличие индола, появляется красное окрашивание среды.

Раствор №1: парадиметиламинобензальгид – 1г

Этиловый спирт (95^о) - 95мл

Соляная кислота (удельный вес 1,19) -20мл

Раствор №2: насыщенный раствор K₂Cr₂O₂.

Определение сероводорода по методу Хоменко

К расплавленному МПА добавляют уксусно-кислый свинец, охлаждают до 45С^о, добавляют яичный белок в количестве 2%, тщательно смешивают со средой, разливают по пробиркам и стерилизуют текучим паром (3 дня по 30мин).

Посевы делают уколом. При наличии способности образовывать H₂S среда по линии укола чернеет.

Приложение 6

ТЕСТОВЫЙ КОНТРОЛЬ УСВОЕНИЯ ТЕМЫ

Выбрать правильные ответы.

1. Назвать назначение дыхания у микробов:

а) конструктивный, пластический обмен

б) энергетический обмен

в) обе функции

г) ни одна из функций

2. Какие органеллы и субстраты участвуют в дыхании бактерий:

а) клеточная стенка, оболочка

б) цитоплазматическая мембрана

в) ферменты

г) все перечисленное

3. На какие группы делятся бактерии по потребности в молекулярном кислороде?

а) факультативные анаэробы

б) облигатные аэробы

в) микроаэрофильные

г) строгие анаэробы

д) аэротолерантные бактерии

д) все перечисленное

4. Какие ферменты дифференцируют аэробы от анаэробов?

а) оксидазы

б) дегидрогеназы

в) пероксидаза

г) каталаза

5. Какие ферменты участвует в в процессе дыхания у анаэробов?

а) оксидазы

б) дегидрогеназы

в) пероксидаза

г) каталаза

6. В чем суть аэробного дыхания?

а) в реакциях окисления конечным акцептором электронов служит молекулярный кислород

б) в реакциях окисления терминальным акцептором электронов служат соединения, содержащие связанный кислород

в) все перечисленные механизмы

7. В чем суть анаэробного дыхания?

а) в реакциях окисления конечным акцептором электронов служит молекулярный кислород

б) в реакциях окисления терминальным акцептором электронов служат соединения, содержащие связанный кислород

в) все перечисленные механизмы.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА:

Основная:

1.Лекция по теме.

2.Методическая разработка по теме.

3. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2006.

4.Биргер М.О. – справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М., 1982. С. 93-96.

Дополнительная:

1. Методическое пособие по микробиологии с вирусологией и иммунологией. Свердловск, 1978 (получить на кафедре).

2. Медицинская микробиология. Под ред. Королюка А.М., Сбойчакова В.Б. С-Пб, 2002. С.21-57.

3. Меджидов М.М. Справочник по микробиологическим питательным средам. М., 2003. С. 97.

4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. С-Пб, 2002.

5. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. Воробьева А.А. М., 2006.

6. Поздеев О.И. Медицинская микробиология. Под ред. Покровского В.И. М., 2006.

51