МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА № 10

ТЕМА: Экологическая микробиология. Нормальная микрофлора организма человека. Генетика и изменчивость микроорганизмов, ее формы, генная инженерия, практическое использование. Плазмиды и их выявление.

МОТИВАЦИОННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА двояка. Она предполагает, с одной стороны, знакомство с микробами - обитателями организма человека (нормальная микрофлора) и окружающей среды (экология), оказывающими взаимное влияние друг на друга. С другой стороны, необходимость познания наследственной основы микробов с формированием различных вариантов изменчивости и роли последней для медицинской науки.

Важное фундаментальное и прикладное значение имеет изучение управляемости наследственной основой микроорганизмов и вопросы генной инженерии.

УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ: знакомство с экологической микробиологией, особенностями наследственности и видами изменчивости микробов, их теоретическим и практическим значением, использованием в современной медицинской науке и практике.

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОГО И ВВОДНОГО КОНТРОЛЯ ЗНАНИЙ

1. Экологическая микробиология. Нормальная микрофлора организма человека и окружающей среды.

2. Наследственность микробов и ее материальная основа.

3. Особенности нуклеоида бактерий.

4. Понятие о генотипе и фенотипе микробов.

5. Структура генома бактерий и прочих микроорганизмов.

6. Контроль экспрессии генов (на примере lас-оперона).

7. Виды изменчивости микробов и факторы их вызывающие.

8. Модификационная изменчивость, ее механизмы и значение.

9. Мутационный процесс: мутации, мутанты, мутагены. Классификация мутаций.

10. Диссоциация бактерий на S- и R - формы, их различие, значение.

11. Выявление ауксотрофных и антибиотико-резистентных мутантов.

12. Репарации поврежденной ДНК, механизм и значение.

13. Генетические рекомбинации у бактерий, механизмы, формы и значение.

14. Трансформация, ее основные этапы, значение.

15. Трансдукция и лизогенная конверсия.

10. Конъюгация, роль F - фактора, особенности Hfr- клеток.

11. Сходство и различия хромосом и плазмид.

10. Классификация и функции плазмид.

19. Транспозоны, строение и функции, значение.

20. Генная инженерия, ее фундаментальное и прикладное значение.

21. Практическое применение методов генетики бактерий в народном хозяйстве, биологии, медицине.

22. Полимеразная цепная реакция (ПЦР), ДНК - зонды, их применение.

23. Мутагенная активность химических соединений и физических факторов, методы их изучения.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫПОЛНЕНИЮ ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ С ПОЛНЫМ РЕГЛАМЕНТОВ ПРОТОКОЛА

№ п/п	Наименование учебного элемента	Методическое решение	Регламент протокола
1.	Нормальная микрофлора человека	Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2005. С. 137-146	Составить список основных микробиоценозов организма человека
2.	Микрофлора окружающей среды (экология)	С.131-136	Составить перечень основных видов микрофлоры воды, воздуха, почвы и пр.
3.	Генетический аппарат микробов	С.93-99	Зарисовать, подписать элементы
4.	Классификация форм изменчивости микробов	С.100-114	Составить схему
5.	Перечень основных достижений генной инженерии в микробиологии	Приложение 1	Вписать в протокол и составить схему
6.	Модификационная изменчивость (временная и длительная)	Приложение 2, 2а	Записать в протокол
7.	Фильтрующиеся формы и их реверсия	Приложение 3	Записать в протокол, зарисовать
8.	Генотипическая изменчивость	Приложение 4	Записать в протокол и заполнить
9.	Рекомбинационная изменчивость	Приложение5	Записать в протокол и заполнить
10.	Плазмиды бактерий	Приложение 6	Заполнить таблицу в протоколе
11.	Применение методов генетики микроорганизмов в медицине	Домашнее задание	Составить перечень в протоколе
12.	Полимеразная цепная реакция (ПЦР)	Приложение 7	Переписать в протокол
13.	Определение мутагенной активности химических веществ	Приложение 8	Записать в протокол
14.	Итоговый тест-контроль усвоения темы	Приложение 9	Сложное записать в протокол.

Приложение 1

ПЕРЕЧЕНЬ ОСНОВНЫХ ДОСТИЖЕНИЙ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ В МИКРОБИОЛОГИИ

Бактериальный объект	Донорный ген-материал	Достигнутый эффект 1
Е. coli	Ген инсулиносинтеза человека	Синтез человеческого инсулина эшерихиями
Е. соli	Ген синтеза интерферонов человеческими лейкоцитами	Синтез человеческого интерферона эшерихиями (реаферон)
Е. coli	Ген синтеза прочих гормонов человека	Синтез человеческих гормонов эшерихиями

Приложение 2

МОДИФИКАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ БАКТЕРИЙ (ВРЕМЕННАЯ)

Объект - бактерии	Изменяющий фактор и контроль	Получаемый эффект изменчивости
Vibrio cholerae	10% р-р NaCl	Полиморфизм: шарообразные клетки в контроле извитые, в виде «запятой»
Proteus vulgaris	МПБ с 0,2% карболовой кислоты, посев в конденсат	Потеря подвижности, ползучего роста нет (в отличие oт контроля)
Serratia marcescens	Рост при разных температурах: 22, 37 С0	Пигментообразование только при низкой температуре +22 С0

При переводе в оптимальные условия наступает реверсия - полное восстановление исходных характеристик.

Приложение 2а

Модификационная изменчивость (длительная)

Вид изменчивости	Действующий фактор	Возможность реверсии
Лекарственная резистентность. Фильтрующаяся форма Диссоциация на S-и R- формы L- формы бактерий	Лекарственный препарат (антибиотик). Массивная антибиотикотерапия. Экстремальные условия. Антибиотики и прочие препараты	После многократных пересевов на оптимальную среду. - « - После прекращения действия индуцирующего фактора (не всегда)

Приложение 3

ЭКСПЕРИМЕНТ ПО ВОССТАНОВЛЕНИЮ (РЕВЕРСИИ) ФИЛЬТРУЮЩИХСЯ ФОРМ БАКТЕРИЙ

- Приготовить фильтрат патологического материала (например, мочи), использовав бактериологический фильтр Зейтца,

• засеять чашки с МПА культурой Sarcina lutea,

- нанести фильтрат пипеткой или петлей на посев сарцины. Поставить в термостaт на 1-3 суток при +39 С⁰,

- учесть готовые результаты посева. Зарисовать колонии ревертанты на сарциновом газоне.

Приложение 4

Виды генотипической изменчивости

Вид изменчивости	Микробная модель компонента	Результат
Трансформация	Пневмококки в голодной среде: серотип I - живой, III- убитый ДНК пневмококка серотип III и живой пневмококк I серотипа	Выделены из среды живые серотипы I и III - « -
Трансдукция с лизогенной конверсией	Бактерии нетоксичные, бактериофаг из токсичных	Выделены токсичные бактерии
Генетическая половая рекомбинация (межвидовая)	Донор F+ E.coli селективные признаки Lac+, Str 5. Реципиент F- S. flexneri признаки Lac-, Str7	Генетические рекомбинанты Lac+, Str2

Приложение №5

СХЕМА ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛОВЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕКОМБИНАНТ

• дизентерийные бактерии F^- - реципиент с главными селективными признаками: Lac^-, Str(r);

• кишечные палочки F⁺ -донор с главными селективными признаками Lac⁺, Str(s);

• минимальная среда (голодная, солевая);

• стрептомицин в порошке;

• 1% раствор лактозы;

• эозин - метиленовый индикатор.

Этапы проведения эксперимента:

- стандартизация скрещиваемых культур по Пехову А. и Абидову А. Реципиент F^- - I млрд. мт/1 мл.

Донор - 250 млн. мт/мл,

• скрещивание культур путем приготовления бактериального кросса F⁺ : F^- в соотношении 4:1,

• инкубация в термостате для конъюгации, 1 час при +37С⁰,

• готовят минимальную среду с селективными добавками и индикатором: расплавить, остудить до +45С⁰, добавить 150 ЕД/мл стрептомицина, 1% лактозы и индикатор эозин 0,4 мг/мл +метиленовая синь 0,065 мг/мл,

• высевают на среду бактериальную смесь кросса и отдельно - исходные культуры на селективные среды,

• инкубировать в термостате при +37С⁰ 1-5 суток,

• учет-обнаружение и изучение половых гибридов. На селективной среде они вырастают только в виде цветных колоний, поскольку рекомбинанты унаследовали от донора признак Lact +, а от реципиента – Str(r).

СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ УЧАСТНИКОВ ЭКСПЕРИМЕНТА

Свойства селективные	Дизентерийные бактерии (реципиент)	Кишечная палочка (донор)	Половой рекомбинант
Отношение к лактозе	Lac - не разлагают	Lac+	Lac+
Отношение к стрептомицину	Str(r) резистентны	Str(s) чувствительны	Str(r) резистентны
Наличие фактора фертильности	F- - отсутствует	F+ - имеется	F+ или F- вариабельно

Реципиент на селективной среде не растет по причине признака Lac^-, неспособности утилизировать единственного источника питания на голодной среде, а донор - из-за присутствия стрептомицина и Str(s).

Приложение 6