Выделение и идентификация бактериофагов

1. Выделение бактериофага из патологического материала больного:

• материал профильтровать через бумажный фильтр, освободить от грубых примесей;

• профильтровать первичный фильтрат через бактериологический фильтр, освободить его от бактерий.

2.Обнаружение бактериофага в материале от больного по методу Отта на плотных питательных средах.

1,5 % МПА разливают в чашки Петри, после его застывания засевают бактерии,предположительно гомологичные искомому фагу.

Для получения сплошного роста 2-3 капли культуры, нанесенные в центре чашки, растирают стерильным шпателем равномерно по всей поверхности. Спустя 5-10 минут после посева на подсушенную среду наносят каплями исследуемый материал с предполагаемым бактериофагом. После того, как жидкость впитается в среду, чашки Петри переворачивают вверх дном, ставят в термостат при +37 С⁰на 18-24 часа. Учет результатов: о присутствии фага свидетельствует полное отсутствие роста культуры на месте нанесения фильтрата.

3. Обнаружение и титрование бактериофага на плотных средах двухслойным методом Грациа.

1,5 % МПА по 30 мл разлить в чашки Петри. После застывания, в течение 2 часов его подсушивают при +18 С.

В пробирку с 2,5 мл 0,7% расплавленного и остуженного агара добавить 0,1 мл

густого смыва суточной агаровой культуры и столько же фильтрата бактериофага Содержимое пробирки перемешать и вылить на первый слой МПА в чашку Петри. После того, как второй слой застынет, чашку поставить в термостат при + 37 С

на 8-10 часов.

Присутствие фага определяют по прозрачным пятнам на мутном матовой фоне глубинного роста бактерий.

Приложение 2

Титрование бактериофага

осуществляется по количеству активных корпускул фага, содержащихся в 1 мл исследуемого фильтрата и обеспечивающих лизис тест-культуры.

Титр выражают отрицательным логарифмом, в котором степень указывает на разведение фага (10 ^-4, 10^-7).

1 .Титрование бактериофага по Аппельману:

• составить ряд из 8 сухих чистых пробирок;

• пипеткой налить в каждую из пробирок по 9 мл МПБ;

• в первую пробирку влить 1 мл фильтрата бактериофага (разведение 1:10 или 10^-1) после чего 1 мл из нее перенести во вторую (разведение 10^-2);

• процедуру повторять до 8 пробирки включительно. Из нее для уравнивания объемов 1 мл вылить в дез. раствор;

• 8 пробирка - контроль с МПБ без бактериофага;

• в каждую пробирку ряда налить по 0,5 мл известной тест-культуры;

• поставить в термостат при +37 С⁰на сутки;

• учесть результаты титрования.

2. Постановка реакции нарастания титра фага (РНТФ)осуществляется с известным бактериофагом и его титром. Бактериофаг вносится в анализируемый объемс предполагаемым инфектом. Через сутки контакта из объекта выделяют бактериофаг и определяют его титр. При отсутствии инфекции титр бактериофага падает, при наличии - растет, а РНТФ соответственно отрицательная и положительная.

Приложение 3