2 модуль / Lekcija_6_Ruseckaja_Reguljacia_Fermentov_Primenenie_v_Medicine

Лекция № 6.

Тема: «Регуляция активности ферментов. Применение ферментов в медицинской практике»

План.

1.Активаторы

2.Ингибиторы

3.Аллостерические ферменты

4.Классификация и номенклатура ферментов

5.Единицы ферментативной активности

6.Применение ферментов в медицине

На скорость химической реакции влияют различные вещества. Те из них, которые тормозят ферментативные процессы, называются ингибиторами. Те же, которые усиливают реакции – активаторами.

1. Активаторы

1.Активаторами ферментов являются их субстраты.

2.Активаторами могут быть кофакторы, т.к. они важные участники ферментативного процесса. Например, металлы, входящие в состав каталитического центра фермента: амилаза слюны активна в присутствии ионов Са, лактатдегидрогеназа (ЛДГ) – Zn, аргиназа – Mn, пептидаза – Mg и коферменты: витамин С, производные различных витаминов (НАД, НАДФ, ФМН, ФАД, КоАSH и др.). Они обеспечивают связывание активного центра фермента с субстратом.

3.Анионы также могут оказывать активирующее влияние на активность фермента (анионы Сl- активируют слюнную амилазу).

4.Активаторами могут служить также вещества, создающие оптимальную рН для проявления ферментативной активности (НСl для создания оптимальной среды желудочного содержимого для активации пепсиногена в пепсин).

5.Активаторами являются также вещества, переводящие проферменты в активный фермент (энтерокиназа кишечного сока активирует превращение трипсиногена в трипсин),

6.Активаторами могут быть разнообразные метаболиты, которые связываются с аллостерическим центром фермента и способствуют формированию активного центра фермента.

2. Ингибиторы Ингибиторы это вещества, которые тормозят активность ферментов. Различают два основных типа

ингибирования:

1.необратимое,

2.обратимое.

1.При необратимом ингибировании ингибитор прочно (необратимо) связывается с активным центром фермента ковалентными связями, изменяет конформацию фермента. Таким образом могут действовать на

ферменты соли тяжелых металлов (ртути, свинца, кадмия и др.), соединения мышьяка и другие токсические вещества, способные привести к необратимой денатурации апофермента (неспецифические ингибиторы).

Йодацетат и ион ацетамида ингибируют активность тех ферментов, в состав активного центра которых входит –SH группа цис, т.е. в данном случае происходит связывание ингибитора с активным центром фермента за счет атома йода, в результате выделяется HI и происходит блокирование –SH группы активного центра. Если эти группы существенны для катализа, то добавление подобных ингибиторов приводит к полной потере активности фермента.

Специфический необратимый ингибитор может связываться с ферментом и инактивировать в его активном центре функциональную группу, которая необходима для проявления его каталитической активности. Например, диизопропилфторфосфат (ДФФ) ингибирует фермент ацетилхолинэстеразу (гидролиз ацетилхолина). В состав активного центра этого фермента входит –ОН группа АК сер. ДФФ соединяется с

–ОН группой сер прочной ковалентной сложноэфирной связью через фосфат.

Обратимое ингибирование - это такой тип ингибирования, когда активность ферментов может восстанавливаться. Обратимое ингибирование бывает 2-х типов:

1.конкурентное

2.неконкурентное

1. При конкурентном ингибировании обычно субстрат и ингибитор очень похожи по химическому строению. При этом виде ингибирования субстрат (S) и ингибитор (I) одинаково могут связываться с активным центром фермента. Они конкурируют друг с другом за место в активном центре фермента. Классический пример, (1) конкурентного ингибирование – торможение действия сукцинатдегидрогеназы малоновой и щавелевоуксусной кислотами:

Многие лекарственные препараты оказывают свое терапевтическое действие по механизму конкурентного ингибирования.

Изучение действия различных ингибиторов на ферментативные реакции имеет очень большое значение в медицине.

Например, (2) Аспирин (ацетилсалициловая кислота) ацетилирует гидроксильную группу остатка серина в активном центре фермента циклооксигеназы, поэтому нарушается синтез простагландинов и тромбоксанов. Благодаря этому аспирин оказывает жаропонижающее действие.

(3) Сульфамидные препараты обладают бактериостатическим действием и применяются для лечения многих инфекционных заболеваний. Сульфамидные препараты являются производными сульфаниловой кислоты и синтезированы на основе белого стрептоцида. Последний похож по строению на п- аминобензойную кислоту (фрагмент витамина Вс), которая необходима бактериям для синтеза нуклеиновых кислот, а, следовательно, для деления клетки. Сульфаниламиды ингибируют синтез витамина

Вс (фолиевой кислоты), который необходим для синтеза нуклеиновых кислот в бактериальных клетках. Благодаря этому сульфаниламидные препараты тормозят процесс деления бактерий, оказывая бактериостатическое действие.

Таким образом, конкурентные ингибиторы уменьшают сродство фермента к субстрату. В случае конкурентного ингибирования судьбу фермента решает концентрация субстрата или ингибитора. При концентрации субстрата большей, чем концентрация ингибитора, субстрат вытесняет ингибитор из активного центра фермента и реакция происходит.

2. Неконкурентные ингибиторы, как правило, связываются с аллостерическим центром фермента. Вследствие этого происходят изменения конформации аллостерического центра, которые приводят к изменению каталитического центра фермента и снижению ферментативной активности.

Часто аллостерическими неконкурентными ингибиторами выступают продукты метаболизма.

3. Аллостерические ферменты Аллостерическими ферментами называют ферменты, активность которых регулируется веществами,

называемыми эффекторами. Эффекторами часто являются различные клеточные метаболиты (например, конечные продукты реакций синтеза и распада).

Аллостерические ферменты обычно олигомерные белки, состоящие из нескольких протомеров; они имеют аллостерический центр, пространственно удаленный от каталитического активного центра.

Существует 4 класса регуляторных ферментов:

1.ферменты, активность которых регулируются при связывании с ними аллостерических модуляторов (положительных – активаторов и отрицательных - ингибиторов),

2.ферменты, регулируемые путем обратимой ковалентной модификации.

3.ферменты, регулируемые частичным протеолизом неактивного предшественника (профермента).

4.ферменты, активность которых регулируются ассоциацией/диссоциацией регуляторных и каталитических субъединиц.

1.Аллостерический центр имеется у сложных ферментов. С аллостерическим центром взаимодействуют различные вещества, чаще всего метаболиты химических реакций клеток (эффекторы или модуляторы). Модуляторы могут быть положительные – активаторы или отрицательные – ингибиторы. Соединение модуляторов с аллостерическим центром приводит к изменению конформации фермента.

Под действием активаторов реакция ускоряется, под действием ингибиторов - тормозится. Поэтому аллостерический центр называют центром регуляции активности фермента. Часто аллостерическими ингибиторами выступают конечные продукты процесса – это ингибирование по принципу обратной связи или ретроингибирование:

2.Регуляция путем обратимой ковалентной модификации осуществляется через процесс фосфорилирования и дефосфорилирования за счет изменения конформации активного центра фермента. При фосфорилировании фермента образуются ковалентные эфирные связи между –ОН группой сер и фосфорной кислотой.

Пример: при фосфорилировании активируются ферменты распада жира и гликогена, а в дефосфорилированном состоянии становятся активны ферменты синтеза. Эти реакции регулируются гормонами (глюкагоном и инсулином).

3.Регуляция частичным протеолизом характерна для ферментов желудочно-кишечного тракта (например, пепсина, трипсина). Неактивная форма фермента (профермент) превращается в активную форму за счет гидролиза одной или нескольких пептидных связей в молекуле профермента. В результате этого происходит конформационная перестройка и формируется активный центр фермента. Например, в результате гидролитического отщепления гексапептида с N-конца трипсиногена формируется активный центр в оставшейся части молекулы.

4.Регуляция каталитической активности ассоциацией/диссоциацией протомеров.

Например, протеинкиназа А состоит из 4 субединиц 2 типов: 2 регуляторных и 2 каталитических. Такой тетрамер не обладает каталитической активностью. Регуляторные субъединицы имеют участки связывания для циклического циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), по 2 на каждую субъединицу. Присоединение 4 молекул цАМФ к 2 регуляторным субъединицам приводит к изменению конформации регуляторных протомеров и к диссоциации тетрамерного комплекса, при этом высвобождаются 2 активные каталитические субъединицы. Такой механизм регуляции обратим. Отщепление молекул цАМФ от регуляторных субъединиц приведет к ассоциации регуляторных и каталитических субъединиц протеинкиназы А с образованием неактивного комплекса.

4. Классификация и номенклатура ферментов Современная классификация ферментов основана на природе катализируемых ими химических

превращений. В основу классификации берется тип реакции, катализируемой ферментом. Согласно решению, принятому в 1972 г комиссией по номенклатуре биохимических соединений Международного союза теоретической и прикладной химии (IUPAC), ферменты разделяют на 6 классов (см. таблицу):

1.Оксидоредуктазы - катализируют окислительно-восстановительные реакции

2.Трансферазы – катализируют межмолекулярный перенос групп

3.Гидролазы – катализируют реакции гидролиз

4.Лиазы – осуществляют реакции по месту двойной связи

5.Изомеразы – катализируют реакции изомеризации

6.Лигазы (синтетазы)- катализируют реакции синтеза с использованием энергии (АТФ)

Каждый класс ферментов делится на подклассы и подподклассы. Например, подклассы эстеразы, гликозидазы, пептидазы у гидролаз.

Номенклатура ферментов

1.Тривиальное название (пепсин, трипсин).

2.Название фермента может складываться из названия субстрата с прибавлением окончания «аза» (аргиназа гидролизует аминокислоту аргинин).

3.Добавление окончания «аза» к названию катализируемой реакции (гидролаза катализирует гидролиз, дегидрогеназа – дегидрирование органической молекулы, т.е. отнятие протонов и электронов от субстрата).

4.Рациональное название – название субстратов и характер катализируемых реакций (АТФ + гексоза гексозо-6-фосфат + АДФ. Фермент: АТФ: D-гексоза-6-фосфотрансфераза).

5.Индексирование ферментов (каждому ферменту присваиваются 4 индекса или порядковых номера): 1.1.1.1 – АДГ, 1.1.1.27 – ЛДГ.

5. Единицы ферментативной активности Международной единицей (МЕ) активности ферментов является количество фермента, способного превратить 1 мкмоль субстрата в продукты реакции за 1 мин при 25 °С и оптимуме рН.

Катал соответствует количеству катализатора, способного превращать 1 моль субстрата в продукт за 1 сек при 25 °С и оптимуме рН.

Удельная активность фермента – число единиц ферментативной активности фермента в расчете на 1 мг белка.

Молярная активность – это отношение числа каталов (МЕ) к числу молей фермента (30 мин)

6. Применение ферментов в медицине.

Развитие энзимологии в медицине имеет особо большое значение. Оно идет по следующим направлениям:

1.Изучение изменений активности ферментов при заболеваниях – Энзимопатологии.

2.Использование ферментных тестов для диагностики заболеваний – Энзимодиагностика.

3.использование ферментов для лечения заболеваний – Энзимотерапия.

1. Энзимопаталогии (или энзимопатии) – заболевания, вызванные нарушением синтеза ферментов. Различают энзимопатии:

1.наследственные (первичные) и

2.приобретенные (вторичные).

Наследственные энзимопатии связаны с нарушением в генетическом аппарате клетки, приводящим к отсутствию синтеза определенных ферментов.

К наследственным (первичные)относятся энзимопатии, связанные с нарушением превращения аминокислот:

1.Фенилкетонурия – наследственное нарушение синтеза фермента фенилаланингидроксилаза, который катализирует превращение аминокислоты фенилаланина в тирозин. При этой патологии происходит увеличение концентрации в крови фенилаланина и патологических продуктов его метаболизма - фенилпирувата и фениллактата, которые оказывают токсическое действие на головной мозг. Фенилпируват выделяется с мочой, и это явление называется фенилкетонурией. Фенилкетонурия сопровождает наследственное заболевание, при котором развивается слабоумие – фенилпировиноградная олигофрения. При этом заболевании у детей необходимо исключить из рациона аминокислоту фенилаланин.

2.Альбинизм – заболевание, связанное с генетическим дефектом фермента тирозиназы. При потере меланоцитами способности синтезировать этот фермент (окисляет тирозин в ДОФА и ДОФА-хинон) в коже, волосах и сетчатке глаза не образуется меланин.

3.Алкаптонурия – выделение с мочой у детей больших количеств гомогентизиновой кислоты, которая окисляется кислородом воздуха и придает моче темное окрашивание («темная моча»). Этот дефект связан с отсутствием фермента печени и почек диоксигеназы гомогентизиновой кислоты. Данная патология может осложниться у детей охронозом – отложением темного пигмента в тканях (нос, уши, склера).

4.Дефект лактазы у новорожденных – вызывается наследственными нарушениями синтеза лактазы – фермента, участвующего в гидролизе лактозы на глюкозу и галактозу. Лактаза вырабатывается железистыми клетками тонкого кишечника. В отсутствие фермента лактоза не расщепляется, и ее используют для питания бактерии кишечника. При сбраживании лактозы бактериями образуется

органические кислоты и СО2. Скопление этих веществ в кишечнике приводит к вздутию и расстройствам кишечника (диарея). Дети, имеющие дефицит лактазы, не могут употреблять молоко в пищу. Заболевание встречается у 10-15% населения.

5.Галактозурия – отсутствие или низкая активность у детей фермента галактозо-1- фосфатуридилтрансфераза. В результате у детей в крови накапливается галактоза, которая выводится с мочой (галактозурия). Заболевание характеризуется помутнением хрусталика глаза (катаракта), замедленным умственным развитием ребенка.

6.Фруктозурия – врожденный недостаток фермента фруктокиназы у детей. У ребенка не образуется фруктозо-1-фосфат. Фруктоза накапливается в крови и выводится с мочой (фруктозурия).

Приобретенные энзимопатии, т.е. нарушение синтеза ферментов, могут возникать в результате:

1.перенесенных соматических заболеваний, например, кишечника, поджелудочной железы;

2.перенесенных инфекционных заболеваний;

3.длительного применения лекарств (антибиотиков, сульфаниламидов);

4.вследствие авитаминозов (отсутствие их в качестве кофакторов);

5.злокачественных опухолей (из-за активной пролиферации опухолевых клеток активность ферментов увеличивается).

2. Энзимодиагностика – применение ферментов для диагностики заболеваний. Для этой цели используются индикаторные ферменты. Их активность в крови здорового человека низкая, но увеличивается при разрушении клеточных мембран определенных органов и тканей. Индикаторные ферменты катализируют реакции только в клетках определенных тканей и органов. Но небольшая часть некоторых из них может проникать через клеточную мембрану в кровь и там обнаруживаться. При заболевании органов, сопровождающихся повреждением клеточных мембран, эти ферменты в большом количестве появляются в крови, свидетельствуя о патологии в определенных тканях.

Например,

1.активность амилазы поджелудочной железы в крови и моче увеличивается при острых панкреатитах.

2.активность γ-глутамилтранспептидазы в крови увеличивается при заболеваниях печени.

3.увеличенная активность аминотрансфераз (аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы) в крови свидетельствует об инфаркте миокарда и заболеваниях печени. При инфаркте миокарда увеличивается в большей степени активность аспартатаминотрансферазы, а при заболеваниях печени – аланинаминотрансферазы.

4.активность кислой фосфатазы увеличивается при карциноме предстательной железы.

Некоторые ферменты локализованы в различных тканях в разных изоферментных формах. Изоферменты – множественные формы фермента, которые отличаются по физико-химическим свойствам апофермента и по локализации в тканях.

Например, лактатдегидрогеназа (ЛДГ) состоит из четырех субъединиц двух типов: Н (от «heart» - сердце) и М (от «muscle» - мышца) благодаря чему образуются 5 изоферментов ЛДГ:

Изоферменты ЛДГ. Активность ЛДГ1 и 2 увеличивается при инфаркте миокарда, активность ЛДГ4 и 5 – при заболеваниях печени и скелетных мышц, активность ЛДГ3 – при заболеваниях почек и селезенки.

Фермент креатинфосфокиназа (КФК) состоит из двух субъединиц двух типов: В (от «brain» - мозг) и М (от «muscle» - мышца), сочетание которых образует три изоферментных формы КФК:

В крови чаще всего исследуется форма МВ, активность этой формы увеличивается при инфаркте миокарда.

Секреторные ферменты – ферменты, выполняющие определенные функции в крови. Они синтезируются в печени и секретируются в кровь, а в крови выполняют определенные каталитические реакции. Например, ферменты системы свертывания крови, сывороточная холинэстераза, липопротеинлипаза, лизоцим и др.

Экскреторные ферменты выделяются из организма и из экскреторных органов, чаще всего из печени с желчью. Например, щелочная фосфатаза выделяется с желчью. Однако, при заболеваниях печени этот фермент тоже может попадать из печени в кровь и активность этого фермента определяется в крови.

3. Энзимотерапия – применение ферментов в качестве лекарственных препаратов. Примеры:

Смесь ферментативных препаратов пепсина, трипсина, амилазы (Панкреатин, фестал) используют при заболеваниях ЖКТ с пониженной секрецией, трипсин и химотрипсин – используются в хирургической практике при гнойных заболеваниях для гидролиза бактериальных белков.

Коллагеназы – в хирургической практике для обработки рубцов, образовавшихся при ожогах, некрозах и т.д.

Гиалуронидаза (лидаза) деполимеризует гиалуроновую кислоту и способствует проникновению в ткань лекарственных веществ.

Протеолитические ферменты плазмин (фибринолизин) применяют для растворения тромбов в кровеносных сосудах.

Лизоцим – для лечения конъюнктивитов.