Определение содержания хлорофилла на фэКе

Прежде чем определять оптическую плотность исследуемого раствора, измеряют плотность серии стандартных растворов со стандартной концентрацией. По результатам этих определений строится калибровочная кривая.

При работе с хлорофиллом используют раствор Гетри в качестве стандартного раствора (для приготовления раствора Гетри в мерную колбу на 100 мл наливают 28,5 мл 1%-го раствора CuS0₄×5H₂0, 50 мл 2%-го раствора К₂Сг₂O₇ и 10 мл 2 н раствора NH₄OH; доливают дистиллированной водой до метки и тщательно взбалтывают; при правильном приготовлении концентрация раствора Гетри соответствует 85 мг/л).

Раствор зеленых пигментов следует колориметрировать с красным светофильтром (680 нм).

Таблица 3

Схема записи опыта

Объект	Навеска, г	Объем вытяжки, мл	Оптиче- ская плотность раствора (D)	Концентрация хлорофилла (мг) в 1 мл раствора, определенная по калибро-вочному графику	Содержание хлорофилла в вытяжке, мг	Содержание хлорофилла в сыром ве- ществе, %

Задание: по шкале прибора определите оптическую плотность раствора; по плотности на калибровочном графике найдите количество хлорофилла (мг) в 1 мл вытяжки. Зная навеску листьев и количество в ней хлорофилла, рассчитайте процентное содержание пигментов в свежих листьях.

Опыт 7. Определение пигментов растений колориметрическим методом

Цель работы: определить содержание хлорофиллов и каротиноидов методом колориметрирования.

Общие принципы экстракции пигментов

Пигменты могут быть экстрагированы из свежего и фиксированного материала. При выборе экстрагирующих веществ необходимо учитывать растворимость пигментов и возможность их выделения данным растворителем из пигментно-липопротеидного комплекса, в виде которого пигменты находятся в пластидах.

В зависимости от химического строения различают растворители полярные (спирты, ацетон) и неполярные (петролейный эфир, гексан, бензин и др.). Степень полярности растворителя определяется величиной его дипольного момента.

Хлорофиллы и каротиноиды, являясь в основном липофильными соединениями, хорошо растворяются во всех растворяющих липиды соединениях: ацетоне, спирте, эфире, бензине, петролейном эфире и т.д.

Однако полное извлечение пигментов из растительного материала достигается только при использовании полярных растворителей или смесью полярных и неполярных растворителей. Полярные растворители, вызывая денатурацию белка и нарушая связи пигментов с липопротеидным комплексом, обеспечивают быструю экстракцию всех пигментов. Для выделения пигментов чаще всего используют 80%-ный ацетон или 90%-ный спирт.

Экстракцию проводят возможно быстрее. Пигменты экстрагируют последовательно несколькими порциями чистого растворителя, отделяя каждый раз раствор пигментов центрифугированием. При растирании навески листьев с растворителем необходимо добавлять небольшое количество СаСО₃, МgСО₃ или 1 н раствор NН₄ОН для предотвращения разрушения пигментов.

Вся подготовительная работа с пигментами ведется в затемненном помещении, на холоду. В ацетоновой вытяжке определяются количественно хлорофилл А, В и каротиноиды спектрофотометрическим способом.