Лабораторная работа № 8

ОБНАРУЖЕНИЕ ПРОЦЕССА ФОТОСИНТЕЗА И ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ПИГМЕНТОВ В РАСТЕНИИ

Опыт 1. Обнаружение процесса фотосинтеза (выделение кислорода водными растениями)

Цель работы: обнаружить фотосинтез у водных растений по выделению пузырьков газа и доказать, что этот газ кислород.

Ход работы: В один сосуд наливают прокипяченную воду (вода без СО₂), в другой – 0,5% раствор гидрокарбоната натрия (вода с СО₂). Отбирают здоровые растения элодеи. Обновляют под водой срезы. На суженные концы воронок надевают пробирки, заполненные тем же раствором, что и в сосудах. Под воронки помещают растения (см. рис. 1). Сосуды с растениями устанавливают под яркий свет. Температура всех жидкостей в опыте должна достигать 26ºС. В пробирки, заполненные газом, который выделяют растения опускают зажженную лучинку. Горение свидетельствует о присутствии кислорода.

Рис. 1. Влияние углекислого газа на выделение кислорода водными растениями: 1. элодея, 2 – воронки, 3 – сосуд с раствором соды, 4 – пробирка с раствором соды, 5 – сосуд с прокипяченной водой, 6 – пробирка с прокипяченной водой.

Задание: сделать рисунки. Отметить время заполнения каждой из пробирок кислородом и сделать выводы о том, что для фотосинтеза необходим СО₂.

Опыт 2. Обнаружение выделенного при фотосинтезе О₂ с помощью метиленового синего

Известный краситель – метиленовый синий способен к окислительно-восстановительным превращениям, он может быть как акцептором ионов водорода, так и их донором. В основе данного опыта лежит свойство метиленового синего давать бесцветное соединение при воздействии восстановителя, и переходить снова в окрашенное соединение при воздействии окислителей Н₂О₂ или О₂.

Цель работы: доказать, что растения на свету выедляют кислород.

Ход работы: в три пробирки наливают водопроводную воду и подкрашивают метиленовым синим до ярко-голубой окраски, а затем добавляют по каплям Na₂SO₃ до обесцвечивания всех трех растворов. Во вторую пробирку наливают пероксид водорода до изменения цвета снова в ярко-голубой, а в третью помещают растение. Все пробирки выставляют на свет и наблюдают за тем, как изменяется в них цвет раствора. Температура среды +26ºС.

Задание: описать опыт; зарисовать пробирки; объяснить причину изменения цвета в пробирках.

Опыт 3. Всплывание на свету инфильтрированных дисков из листьев.

У наземных растений выделяющийся при фотосинтезе кислород накапливается в межклетниках листа. Если межклетники листа заполнены газом, то плотность тканей листа мала и лист плавает на поверхности воды. Если межклетники заполнены водой, то лист оседает на дно. Кислород, выделяющийся при фотосинтезе, вытесняет из межклетников воду, лист становится легче и всплывает на поверхность.

Цель работы: определить интенсивность фотосинтеза по выделению О₂ в зависимости от освещенности.

Ход работы: пробочным сверлом из листа делают высечки и инфильтруют их водой, насыщенной СО₂. Инфильтрированные высечки помещают по 6 штук в стаканчики с водой, обогащенной СО₂. Один из стаканчиков помещают в темноту (контроль), другие выставляют на свет на разные расстояния от его источника и засекают время. Высечки всплывают в разное время в зависимости от интенсивности света (расстояние от лампы 0, 25, 50, 100 см) в результате вытеснения воды из межклетников кислородом, образующимся при фотосинтезе. Высечки, находящиеся в темноте, не должны всплывать. Мерой интенсивности фотосинтеза служит время, прошедшее с момента установки стакана с инфильтрованными высечками на свет до всплывания 50% высечек.

Задание: определить время всплывания высечек в стаканчиках, установленных на разном расстоянии от лампы. Сделать вывод о влиянии интенсивности света на интенсивность фотосинтеза.

Опыт 4. Изменение окраски крезолового красного при поглощении листом со2.

Цель работы: доказать, что живой лист растения поглощает СО₂ из воздуха при фотосинтезе. Для этого используют индикатор – крезоловый красный, который меняет свою окраску при изменении рН среды.

Ход работы: в три сосуда наливают водопроводную воду до ½ объема. В I сосуд – воду, содержащую СО₂ не более 0,3% (как в воздухе), со значением рН, близким к нейтральной, во II сосуд – прокипяченную воду, остуженную при закрытой пробке (без СО₂), со слабощелочной реакцией, в III сосуд – воду, обогащенную СО₂ путем 10-ти минутного вдувания через трубочку вдыхаемого воздуха, со слабокислым значением рН, которое обусловлено наличием в воде СО₂.

Во все три сосуда добавляют одинаковое количество крезолового красного до окрашивания растворов: в I – до темно-желтого, во II – до красного, в III – до светло-желтого. К пробке III сосуда крепят крючок, на крючок надевают лист и опускают в сосуд. Сосуды выставляют на свет. Спустя 12 часов отмечают изменения, произошедшие с растворами индикатора. В III сосуде лист поглощает НСО₃^- из раствора, и он изменяет желтую окраску на красную в связи с изменением значения рН до слабощелочного (таблица 1).

Таблица 1

Вариант опыта	Окраска крезолового-красного	рН среды	Изменения окраски
СО2 мало	Темно-желтая	Нейтральная
СО2 отсутствует	Красная	Слабощелочная
СО2 много+лист	Светло-желтая	Кислая

Задание: данные опыта внести в таблицу, объяснить причину изменения окраски.

Опыт 5. Фотосенсибилизирующее действие хлорофилла на реакцию переноса водорода (по Гуревич)

Сущность световой фазы фотосинтеза заключается в окислении воды до молекулярного кислорода с помощью световой энергии, поглощенной хлорофиллом. Освобождающиеся при этом электроны передаются затем через цепь промежуточных переносчиков к НАДФ, который восстанавливается до НАДФ·Н₂. Кроме того, при переносе электронов часть энергии расходуется на образование АТФ, т. е. фотосинтетическое фосфорилирование.

Считают, что в переносе электронов воды к НАДФ участвуют последовательно две пигментные системы, которые содержат различные формы хлорофилла а, отличающиеся максимумами поглощения в длинноволновой части спектра. В первую систему входят также каротиноиды, а во вторую- хлорофилл b и ряд других вспомогательных пигментов.

Итак, конечный результат фотоокисления воды - выделение молекулярного кислорода и образование богатых энергией и восстановительной силой соединений - АТФ и НАДФ-Н₂, необходимых для последующего восстановления углекислого газа.

Упрощенную схему фотолиза воды можно представить сле­дующим образом:

H₂O + HAДФ + АДФ + Н₃РО₄ (свет, Хл) → НАДФ·Н₂ + АТФ + 1/2О₂

Как видно из уравнения, хлорофилл выполняет здесь функцию - фотосенсибилизатора, способствующего переносу электрона (водорода) к НАДФ.

Фотосенсибилизирующая роль хлорофилла может быть продемонстрирована в модельных реакциях с выделенным из растений пигментом. Для этого в качестве источника водорода берут аскорбиновую кислоту, а акцептора водорода - метиловый красный, который, присоединяя водород, восстанавливается в неокрашенное лейкосоединение. Аскорбиновая кислота окисляется в дегидроаскорбиновую кислоту по схеме:

АН₂ + М + Хл → А + МН₂ + Хл,

где АН₂ - донор электронов (аскорбиновая кислота);

М - акцептор электронов (метиловый красный);

А - дегидроаскорбиновая кислота;

МН₂ - бесцветная лейкоформа метиловый красный,

Хл - хлорофилл.

Цель исследования: установить роль хлорофилла как фотосенсибилизатора в процессах переноса электронов к НАДФ+.

Объекты исследования - спиртовая вытяжка из листьев амариллиса, плюща или других растений.

Реактивы: 85%-ый этиловый спирт, СаСО₃, аскорбиновая кислота (кристаллическая), метиловый красный (насыщенный раствор в этиловом спирте), раствор хлорофилла (спиртовая вытяжка из листьев).

Оборудование - пробочные сверла 8-10 мм, ножницы, колбы на 100 мл (2 шт.), воронки (2 шт.), стеклянная палочка, бумажные фильтры, кварцевый песок или толченое стекло, вазелин, колба Бунзена, стеклянный фильтр № 2 или № 3, насос Камовского или водоструйный, градуированные пипетки на 10 мл и на 1 мл, средние пробирки, штатив, электрическая настольная лампа на 300 Вт., стеклянный сосуд с плоскопараллельными стенками.

Схема исследований:

1. Вытяжка хлорофилла + аскорбиновая кислота + метиловый красный + свет (контрольный вариант).

2. Вытяжка хлорофилла + аскорбиновая кислота + метиловый красный + темнота.

3. Вытяжка хлорофилла + метиловый красный + свет.

4. Спирт + аскорбиновая кислота + метиловый красный.

Методика исследований

А. Получение спиртового раствора (вытяжки) пигментов зеленого листа

Из листьев растений (не затрагивая крупных жилок) пробочным сверлом вырезают диски. Из них составляют навеску в 1,0-1,5 г. Для расчета поверхности листьев взятой пробы необходимо сосчитать количество дисков и измерить их диаметр.

Навеску листьев переносят в фарфоровую ступку и растирают с небольшим количеством этилового спирта, прибавив предварительно на кончике ножа СаСОз (для нейтрализации кислот клеточного сока) и чистого кварцевого песка (для лучшего растирания). Носик ступки с наружной стороны смазывают вазелином. После небольшого отстаивания зеленый раствор осторожно (чтобы не потерять ни капли раствора) по палочке сливают в воронку с пористым стеклянным фильтром. С помощью масляного или водоструйного насоса фильтруют вытяжку в колбу Бунзена. Оставшуюся в ступке густую массу снова растирают со спиртом. После отстаивания жид­кость переносят на фильтр.

Эту операцию повторяют несколько раз, пока раствор, стекаю­щий из воронки, не будет бесцветен. Переносят спиртовую вытяжку из колбы Бунзена в мерную колбу на 25-50 мл, спиртом доливают до метки и перемешивают. Полученный зеленый раствор содержит следующие пигменты.

1. Зеленые:

хлорофилл «a» C₃₂H₃₀ON₄Mg (COOCH3) (СООС₂₀Н₃₉);

хлорофилл «б» C₃₂H₂₈O₂N₄Mg (СООСНз) (СООС_2оН₃₉).

2. Желтые:

каротин С_4оН_5б; ксантофилл С_4оН_5бО₂.

С полученной вытяжкой производят ряд исследований и определяют количество хлорофилла в ней.