MaltsevSciD

Во первых, рассмотрим оптическую модель эритроцита. Эритроцит моделируется гомогенным раствором гемоглобина в воде (~34 g/dl), с солью (~0.7 g/dl) и другими органическими компонентами (~0.2 g/dl) [14], содержащимися в клеточной мембране пренебрежимо малой толщины. Поэтому, с точки зрения светорассеяния, сферизованный эритроцит характеризуется размером и комплексным показателем преломления n’ = nR' - i nI' , где nR' - реальная часть, nI' - мнимая часть показателя преломления. Так как внутренний объем клетки полностью занят водой и гемоглобином, изменения в n’ от клетки к клетке можно связать с изменением гемоглобина. Так для реальной части показателя преломления эта связь выражается следующим уравнением:

(3.35)

nR' - n0 = β× HbC,

где β - коэффициент размерностью dl/g, n0 – показатель преломления окружающей среды. Для интересующего нас интервала длин волн (от 0.5 до 1.2 мкм) β имеет типичное значение 0.0019 dl/g. Для этого же диапазона длин волн можно записать выражение для мнимой части показателя преломления:

где σ - сечение поглощения гемоглобина (8.1 10-18 см2 для λ = 632.8 нм), M – молекулярный вес гемоглобина (66500), NA – число Авагадро (6.02 1023). Таким образом для данной длины волны комплексный показатель преломления эритроцита определяется с помощью уравнений (3.35) и (3.36) через единственную переменную – концентрацию гемоглобина HbC.

121

Рис. 3.27. Зависимость параметра размера α от расстояния между минимумами ∆ 2(15).

122

Рис. 3.28. Зависимость параметра набега фазы ρот контраста индикатрисы

Vf(15).

123

Для получения параметрического решения обратной задачи светорассеяния для этого случая были рассчитаны индикатрисы по теории Ми. При этом размер частицы d изменялся от 4 мкм до 7.5 мкм с шагом 0.1 мкм

(параметр размера α изменялся при этом от 26 до 50), концентрация гемоглобина менялась от 5 g/dl до 45 g/dl с шагом 0.5 g/dl (при этом параметр набега фазы ρ= 2α (nR-1) = 2αβ× HbC менялся от 0.4 до 6.3, параметр поглощения

ε = 2α nI = dσ× HbC NMA 10-4 менялся от 1.5 10-5 до 2.5 10-4), где nR = nR' /n0, nI

= nI' /n0. Индикатрисы рассчитывались при следующих параметрах: длина волны падающего излучения λ = 0.6328 мкм, показатель преломления среды n0=1.333. Параметр набега фазы имеет смысл разницы в фазе для волны, прошедшей через центр частицы, и волны в отсутствии частицы. Параметр поглощения имеет смысл затухания амплитуды волны, прошедшей через центр частицы.

Ранее мы показали, что параметры индикатрисы ∆ 2(15) и Vf(15) обладают разной чувствительностью к изменению характеристик частицы и поэтому могут эффективно использоваться в параметрическом решении обратной задачи. Однако и для вышеупомянутой области изменения характеристик частицы, минимумы индикатрисы пересекают граничный угол, что приводит к разделению всей области на зоны, соответствующие номеру триады экстремумов. Эти зоны легко отделяются друг от друга, используя параметрическую карту, представленную на Рис. 3.26. Зависимость параметра размера α от расстояния между минимумами ∆ 2(15) представлена на Рис. 3.27. Как видно из представленных данных, зависимость не отличается для различных зон области и, поэтому, аппроксимационные уравнения, связывающие параметр размера частицы и параметры индикатрисы, отличаются не значительно. В противоположность этому, зависимость параметра набега фазы ρ от контраста индикатрисы Vf(15) отличается для разных зон области (Рис. 3.28).

Аппроксимационные уравнения, связывающие параметры индикатрисы ∆ 2(15) и Vf(15) и параметры частицы α и ρ, получаются с помощью метода наименьших квадратов, аппроксимируя данные на Рис. 3.27 и Рис. 3.28

124

различными комбинациями параметров индикатрисы. Для параметра размера следующее уравнение обеспечило наименьшее значение χ 2:

где pi – коэффициенты, значения которых представлены в Табл. 3.3. Приведенные коэффициенты обнаружили максимальное влияние на точность вычисления параметра размера. Особенно это касается коэффициента p1, как и в случае не поглощающих частиц.

Другое уравнение связало параметры индикатрисы и параметр набега фазы. Уравнение подбиралось аналогично приведенному в разделе 3.3.5.1. Данные на Рис. 3.28 аппроксимировались уравнением, содержащим различные степени ∆ 2(15) и Vf(15), и удовлетворяющим граничным условиям. А именно: ρ= 0 при Vf(15) = 1 и Vf(15) ≥ [Vf(15)]крит. Параметр q4 является минимально возможной контрастностью индикатрисы. Это уравнение имеет следующий вид:

где qi – определенные в результате аппроксимации коэффициенты. Значения коэффициентов приведены в Табл. 3.3. Так как в данном разделе мы рассматривали конкретный пример с эритроцитами, то размер эритроцита и содержание гемоглобина в нем определяются далее, используя определения параметров частицы α и ρ=2αβ× HbC.

125

Табл. 3.3. Аппроксимационные уравнения и их коэффициенты, используемые при вычислении параметра размера и параметра набега фазы

сферической частицы с поглощением.

126

Окончательно алгоритм определения содержания гемоглобина в эритроците и его размера выглядит следующим образом:

(1) вычисляются параметры индикатрисы эритроцита L(15), ∆ 2(15) и Vf(15));

(2)определяется номер зоны по параметрической карте ∆ 2(15) от L(15) (Рис.

3.26);

(3)вычисляются параметры частицы α и ρ по уравнениям (3.37) и (3.38) с использованием данных Табл. 3.3;

(4)размер эритроцита и содержание гемоглобина в нем вычисляются по формулам: d = αλ /(π m0) и HbC = 1/(2ραβ ).

3.3.5.3. Индикатриса одиночной частицы в сильно сфокусированном световом поле.

При изучении рассеяния на одиночных частицах в сканирующей проточной цитометрии представляется важным рассмотреть влияние фокусировки на индикатрису. Это вызвано тем, что всегда есть желание, как можно сильнее сфокусировать падающее лазерное излучение, чтобы добиться максимальной чувствительности в измерениях индикатрис. Рассмотрение можно провести со сферическими гомогенными частицами, для которых существует обобщенная теория Ми [103]. В классической теории Ми частица облучается плоской монохроматической волной, тогда как в обобщенной теории Ми, падающее излучение представляется в виде пучка с гауссовым распределением интенсивности по сечению пучка.

Рассмотрим частицу диаметром d и с относительным показателем преломления m расположенной в центре декартовой системы координат.

Падающее излучение длиной волны λ с гауссовым распределением распространяется вдоль оси z. Тогда согласно обобщенной теории Ми интенсивности полярной и радиальной поляризации рассеянного света выражаются следующей формулой [103]:

127

где амплитудные функции рассеяния задаются выражением:

Где an и bn – классические коэффициенты рассеяния, π n и τn – функции Лежандра [75]. Эти выражения идентичны выражениям классической теории Ми за исключением множителя gn. Данный множитель и определяет влияния радиального распределения интенсивности на индикатрису одиночной частицы.

Функция f – это радиальная функция, содержащая основную информацию относительно падающего излучения. Для общей теории Ми можно написать для

128

где ω0 – радиус перетяжки гауссового пучка, l = kω02– длина перетяжки, ω+

= ω0/l.

Для расчета коэффициентов an и bn и функций π n и τn в литературе описаны эффективные алгоритмы [75], тогда как расчетные формулы для вычисления gn находятся в процессе разработки. К настоящему времени в литературе доступны четыре способа расчета коэффициентов gn: 1) метод квадратур, 2) метод бесконечных сумм, 3) метод локализованных приближений, 4) метод s- расширений [105]. Для того чтобы рассчитать рассеяние от частицы в сильно сфокусированном гауссовом пучке, мы воспользуемся методом локализованных приближений [106].

Нами было разработано специальное программное обеспечение, реализующее алгоритм расчета индикатрис одиночных частиц методом локализованных приближений. В качестве примера была рассчитана индикатриса сферической частицы диаметром 3 мкм и показателем преломления 1.58 для различных диаметров перетяжек гауссового пучка. Результаты расчетов представлены на Рис. 3.29. Как видно из результатов, индикатриса не сильно модифицируется, если диаметр перетяжки в 3 раза превышает размер частицы. Изменения становятся значительными при одинаковых значениях диаметров перетяжки и частицы. Индикатриса становится совершенно другого вида в случае, когда диаметр перетяжки в три раза меньше, чем диаметр частицы.

129