5. Контрольные вопросы

1. Что такое лабораторная диагностика?

2. Каковы задачи лабораторной диагностики, как научного раздела клинической медицины?

3. Классификация методов лабораторной диагностики.

4. Источники вариабельности лабораторных показателей.

5. Что такое референтные лабораторные показатели, как они определяются.

6. Что такое чувствительность и специфичность лабораторного теста, каково их клиническое значение?

7. Характеристики лабораторных методов: чувствительность, специфичность, правильность, воспроизводимость.

8. Принципы интерпретации данных лабораторных тестов.

Микробиологическаяи иммунологическая диагностика в хирургии:

Большая доля заболеваний человека, в том числе и хирургических заболеваний, вызывается микробами, выступающими этиологическим (причинным) фактором. Выявление этого фактора может быть определяющим для исхода заболевания, так как сейчас имеются достаточно эффективные средства подавления микрофлоры в очаге инфекции и организме в целом - химические антисептики, антибиотики, сыворотки, вакцины. Но, к сожалению, клиническая диагностика дает лишь косвенные признаки инфекции и не может определить микроба непосредственно. Клиника инфекционного заболевания может быть специфической (актиномикоз, столбняк, туберкулез), то есть характерной именно для данного заболевания и данного возбудителя, но чаще она неспецифична. Так, гнойные процессы, составляющие большинство в структуре общехирургической патологии, могут быть вызваны десятками возбудителей, и при этом разницы в симптомах не будет наблюдаться, и в таком случае нельзя с уверенностью назначать лечение. В любом случае, выявление причинного фактора инфекционного заболевания позволяет лечить человека целенаправленно и обоснованно, что и составляет основное назначение микробиологической диагностики.

Не менее важно и профилактическое значение микробиологической диагностики. При ее помощи можно выявлять скрытые очаги инфекции в организме носителей микроба - пациентов и медработников, предупреждая затем распространение микроба в окружающей среде и возникновение заболеваний. Кроме того, микробиологическая диагностика позволяет объективно оценивать качество работы медперсонала по предупреждению распространения инфекций путем исследования рук, инструментов, воздуха в операционной, препаратов и имплантатов на наличие микрофлоры.

Микробиологическая диагностика - лабораторная диагностика, направленная на идентификацию возбудителя, определение его свойств или на выявление иммунного ответа организма больного на него.

Данная диагностика осуществляется в условиях специальных микробиологических лабораторий, которые редко имеются в лечебных учреждениях, как правило, такие лаборатории централизованы и обслуживают несколько клиник. Микробиологические лаборатории должны быть изолированы от помещений лечебных учреждений, доступ в них резко ограничен.

Начальным этапом микробиологической диагностики является отбор материала и транспортировка проб в лабораторию. Вид материала для исследования определяется особенностями заболевания. Берут для исследования тот материал, где может присутствовать предполагаемый возбудитель инфекции - это может быть раневое отделяемое, кровь, моча, кал, мокрота, смывы с кожи и слизистых. Так, при сепсисе обязательному исследованию подлежит кровь и гной из первичного очага инфекции или гнойных метастазов. Существует несколько общих условий взятия материала. Для более достоверного результата пробы рекомендуется брать до начала антибактериальной терапии или после выведения антибактериального препарата из организма. При взятии материала соблюдают правила асептики, то есть предупреждать попадание посторонней микрофлоры в пробы. Количество материала должно быть достаточным для проведения анализа. Материал, полученный от больных с хроническими вялотекущими инфекционными процессами, содержит меньше микроорганизмов, чем при остром процессе. поэтому для выделения возбудителя требуется большее его количество. Образцы материала собирают в стерильную посуду, которую маркируют и направляют в лабораторию.

В сопроводительном документе (направлении) приводят сведения о характере материала, времени его взятия, данные о больном, включающие предполагаемый клинический диагноз и перечисление антибиотиков, использованных в лечении, указывают название учреждения, отделения, направляющего материал.

Транспортировку материала для исследования осуществляют в предельно сжатые сроки. Охлаждение материала в холодильнике при t° +4° позволяет увеличить время до начала исследования на 30—60 мин. Более длительное хранение может привести к гибели возбудителей или изменению количественных соотношений частей микрофлоры. Поэтому в случаях, когда хранение и транспортировка длятся более суток, используют консервант или транспортные (поддерживающие, накопительные) среды и специальные средства, сохраняющие жизнедеятельность микроорганизмов (глицерин). Так, для транспортировки образцов материала. предназначенных для выделения анаэробных бактерий, применяют герметизированные флаконы или пробирки, заполненные бескислородным газом.

В некоторых случаях посев необходимо производить ex tempore (при менингококковой инфекции, дизентерии). Методы, позволяющие провести посев материала у постели больного, значительно повышают вероятность выделения возбудителя.

Кровь для исследования антител охлаждают до +4 градусов, но не замораживают во избежание геиолиза, и транспортируют, сроки транспортировки не так критичны, поскольку антитела относительно стабильны.

Все методы микробиологической диагностики можно разделить на микроскопические, бактериологические, биологические и серологические.

Микроскопия микроорганизмов широко применяется в микробиологической диагностике. Так, микроскопию бактерий (бактериоскопию) проводят при анализе исходного материала от больного, а также после выращивания возбудителей на жидких или твердых питательных средах и визуального изучения особенностей выросших колоний. При этом можно определить морфологию микроба - форму, размеры, параметры окраски. Наиболее распространенным методом окраски препаратов для бактериоскопии является метод Грама и его модификации. С помощью метода бактерии подразделяют на две группы: грамположительные, окрашенные в сине-фиолетовый цвет, и грамотрицательные, имеющие розовый или красный цвет. При целенаправленном поиске какого-либо возбудителя применяют специальную окраску.

Нахождение в мазках грамположительных кокков (типа ланцетовидных диплококков). окруженных зоной не окрасившейся капсулы. может свидетельствовать о наличии пневмококков. Если обнаруживают грамположительные кокки, расположенные цепочкой, то предполагают, что в исследуемом материале содержатся стрептококки. Расположение грамположительных кокков в виде гроздей винограда может указывать на присутствие стафилококков. Грамотрицательные палочки различной величины, окруженные капсулой в виде светлого ореола. характерны для клебсиелл, а бескапсульные палочки — для синегнойной палочки, эшерихий, протеев и других энтеробактерий. При обнаружении в мазках грамположительных длинных палочек предполагают наличие споровых анаэробов или аэробов.

Другое важное тинкториальное свойство бактерий (отношение к окраске) связано с тем, что не которые кислотоспиртоустойчивые бактерии не обесцвечиваются смесью кислоты со спиртом после окрашивания горячим раствором карболового фуксина Циля. Это свойство выявляется при окраске по методу Циля — Нельсена микобактерии туберкулеза и отдельных родственных им бактерий, а также некоторых актиномицет и спор бактерий, которые окрашиваются в красный цвет. а остальные элементы мазка — в синий.

Фазово-контрастная микроскопия микроорганизмов в нативном состоянии имеет ограниченное применение, главным образом при выявлении их подвижности, изучении морфологии микроорганизмов, лишенных клеточной стенки (микоплазм и L-форм бактерий). Для приготовления препаратов живых микробных клеток используют суспензии культур микроорганизмов. выращенных в жидких и на плотных питательных средах.

Микроскопия микроорганизмов позволяет выявлять форму, морфологические особенности микробных клеток, их подвижность, что дает возможность без постановки дополнительных тестов составить представление о возбудителе и приступить к бактериологическим методам исследования. Микроскопия - достаточно быстрый, но недостаточно специфичный метод диагностики, так как видов патогенных микробов неизмеримо больше, чем вариантов их морфологии.

Бактериологический метод является основным в идентификации возбудителя-бактерии. Основными этапами метода являются посев материала на питательные среды, выделение чистой культуры (популяции микроорганизмов одного вида), идентификация и дифференциация выделенных культур, определение чувствительности изолированных микроорганизмов к антибиотикам и антисептикам.

Используемые для посева среды разнообразны по составу ит консистенции (жидкие, полужидкие и плотные). В зависимости от цели бактериологического исследования, а также на основании результатов бактериоскопии, изучения эпидемической ситуации (т.е. предполагаемой видовой принадлежности микробов) осуществляют выбор одной или нескольких питательных сред для посева.

Изучение особенностей роста микроорганизмов на средах, содержащих различные вещества и индикаторы, определяющие процесс их ферментации бактериями, позволяет судить об их культуральных свойствах. При росте в жидких средах отмечают степень ее прозрачности, наличие осадка или пленки на поверхности среды. При изучении колоний на плотных питательных средах обращают внимание на их размер, прозрачность, форму, особенности очертаний, плотность, консистенцию, наличие пигмента, специфического запаха, гемолиза и т.д.

Выделению чистых культур возбудителей способствует использование элективных и селективных сред (обеспечивающих избирательный рост определенных видов микроорганизмов). Посев материала для исследования на дифференциально-диагностические среды (содержат как вещества, угнетающие рост посторонней микрофлоры, так и субстраты для выявления отдельных ферментов) позволяет оценить чистоту культуры возбудителей, сопоставить относительную численность колоний каждого типа по цвету колоний на питательной среде в результате изменения индикатора. Так, дифференцирующим субстратом в средах Эндо, Плоскирева, Мак-Конки является лактоза, по отношению к которой отличают бесцветные колонии бактерий, не ферментирующие этот углевод (шигеллы, сальмонеллы и др.), от окрашенных колоний, обладающих этой способностью (большинство энтеробактерий).

На основании изучения культуральных свойств микроорганизмов определяют, к какой из систематических групп относится полученная чистая культура возбудителя, что важно для идентификации возбудителя. Чаще всего идентифицируют род и вид выделенной культуры возбудителя, исследуя при этом ее биохимическую активность.

В ряде случаев микробиологическая диагностика включает в число своих задач идентификацию до уровня отдельных штаммов, что особенно важно при выявлении источника заражения и путей распространения возбудителей. При этом помимо исследования биохимических особенностей штамма проводят типирование с помощью типовых сывороток, бактериофагов, и бактериоцинов (колицинов, пиоцинов и др.), определяют антибиотикограммы (показатели чувствительности микроорганизмов к антибиотикам) и т.д.

Определение антибиотикограмм является основным этапом микробиологической диагностики, обеспечивающим выбор оптимального препарата для антибактериальной терапии. Ведущим методом определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам является дискодиффузионный метод, отличающийся простотой выполнения и экономичностью. Метод основан на измерении диаметра зон задержки роста испытываемого микроорганизма вокруг бумажного диска с антибиотиком. Наиболее точными в количественном отношении являются методы последовательных (серийных) разведений антибиотиков в жидкой или плотной питательной среде. Мерой чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам при использовании этих методов служит минимальная подавляющая концентрация (МПК) — наименьшая концентрация антибиотика, которая подавляет развитие штамма бактерий при стандартных условиях постановки опыта. Знание минимальной подавляющей концентрации позволяет выбрать оптимальную дозу препарата.

Критерии чувствительности микроорганизмов к антибиотикам зависят не только от микроорганизмов, но и от концентрации антимикробного препарата в патологическом очаге, его фармакокинетических и фармакодинамических свойств (величины максимальной терапевтической дозы, токсичности и т.д.). Чувствительными к химиотерапевтическому препарату считаются те микроорганизмы, на которые он оказывает бактериостатическое или бактерицидное действие в концентрации, близкой к концентрации, достигаемой в очаге инфекции. При отношении минимальной подавляющей концентрации препарата к концентрации препарата в очаге поражения в случае введения терапевтической дозы менее единицы микроорганизмы расцениваются как чувствительные, а при отношении, равном единице или более, микроорганизмы относят к устойчивым. Для достижения терапевтического эффекта необходимо создание в крови концентрации препарата, примерно в 4—8 раз превышающей минимальную подавляющую концентрацию. Поскольку уровень концентрации препаратов в очагах варьирует у больных в широких пределах, один и тот же возбудитель может быть одновременно охарактеризован как чувствительный и как устойчивый для одного и того же больного.

Биологический метод (метод биологических проб) используется в микробиологической диагностике для обнаружения возбудителя в организме больного, выделения культуры возбудителя и определения его патогенности. Биологический метод основан на заражении восприимчивых лабораторных животных исследуемым материалом (кровь, выделения больного) или чистой культурой возбудителя. Его применяют при зоонозных инфекциях (чуме, туляремии и др.). а также для обнаружения токсинов возбудителей. Чаще пробы ставят на белых крысах, мышах, морских свинках и кроликах. Заражение в зависимости от целей постановки биологической пробы производят перорально, интраназально, внутривенно, накожно, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно и субдурально.

Вирусологический метод предполагает культивирование вируса на восприимчивых животных, культурах клеток или курином эмбрионе. Эти субстраты заражают материалом, полученным от больного и после накопления вируса его типируют при помощи сывороток, так как самостоятельным метаболизмом и культуральными свойствами вирус не обладает.

В диагностике инфекционных болезней используют реакции иммунитета, которые в зависимости от принципа используемого метода делят на две группы: по известным антителам определяют неизвестный антиген (возбудитель); по известным антигенам выявляют неизвестные антитела в сыворотке крови.

При многих инфекциях соответствующие антитела появляются, через 7-14 дней после того, как возбудители начинают размножаться в организме, и сохраняются несколько месяцев или лет. Выявление антител не всегда связано с текущим заболеванием, а может указывать на контакт с возбудителем в прошлом. Поэтому диагностическое значение имеет нарастание титра антител за 5-7 суток. Определение антител из-за анамнестических, прививочных и перекрестных реакций лишь относительно достоверно и в лабораторной практике имеет вспомогательное значение.

Кожные тесты (выявление повышенной реактивности кожи при антигенном раздражении) также могут быть положительны не только при наличии инфекции, но и указывать на то, что организм был инфицирован в прошлом. Реакцию кожи может подавлять ряд заболеваний, гормональная и иммунодепрессивная терапия, что в свою очередь, приводит к ложноотрицательным результатам тестирования.

К более перспективным относят методы, основанные на обнаружении в ранней стадии болезни микробных антигенов в сыворотке крови. К таким методам относится реакция цепной полимеризации (ПЦР), протекающая в случае реакции «антиген-антитело». Метод высоко чувствителен и специфичен.

Заключительным этапом микробиологической диагностики является составление ответа (заключения), который дает бактериологическая лаборатория по окончании анализа. Ответ содержит информацию, необходимую для установления клинического диагноза и назначения рационального лечения: перечень всех видов микроорганизмов, выделенных из исследуемого материала, их количественное содержание, чувствительность к антибактериальным препаратам каждой культуры микроорганизма, при необходимости отмечают особые характеристики и свойства выделенной микрофлоры, дают рекомендации по проведению дальнейших и дополнительных исследований.

Интерпретация результатов микробиологической диагностики зависит от многих клинических и лабораторных показателей. Так, если микроорганизм изолирован из пробы материала, который в норме стерилен (кровь, цереброспинальная жидкость), то он рассматривается как возбудитель заболевания, хотя существует ряд исключений (например, транзиторная бактериемия). В этих случаях на наличие инфекции могут указывать отклонения от нормы результатов клинических анализов — лейкоцитоз, нарастающая анемия, сдвиг лейкоцитарной формулы влево до палочкоядерных нейтрофильных гранулоцитов, повышение концентрации С-реактивного белка и т.д. Когда исследуемый материал (фекалии, мокрота, смывы с кожи и др.) содержит микроорганизмы в норме, учитывают качественные и количественные изменения в составе микрофлоры, появление нетипичной микрофлоры для данной системы органов, повторность ее выделения и т.д. Поскольку начало развития инфекционного процесса сопряжено с колонизацией возбудителя и достижением им определенного критического числа, его количественное содержание в тканях или биологических жидкостях многократно выше, чем сопутствующей микрофлоры

При многих инфекционных болезнях, в том числе гнойно-септических лаборатория сообщает окончательный ответ через 4-6 дней, а при туберкулезе, бруцеллезе — через 3—4 нед. Возросшая потребность в оптимизации труда клинико-микробиологических лабораторий и сокращении сроков получения результатов стимулировала разработку экспресс-методов, позволяющих регистрировать результаты через 3—6 ч, то есть в день проведения исследования. а не на следующие сутки, что чрезвычайно важно в экстренных клинических ситуациях. Новые системы и методы микробиологического анализа менее трудоемки и более экономичны, что имеет большое значение при массовых обследованиях с целью выявления скрытых инфекций. Их развитие идет по пути миниатюризации и автоматизации (компьютеризации) исследований, при этом для регистрации жизнедеятельности бактерий используют разнообразные принципы: фотометрический, кондуктометрический, радиометрический, биолюминесцентный, газохроматографический, колориметрический и многие другие. Наиболее разработаны методы регистрации оптической плотности или электропроводности жидкой питательной среды в процессе роста бактерий.

Данные микробиологической диагностики необходимы и широко используются в решении задач научной и клинической медицины, эпидемиологии, больничной гигиены. Они помогают при расшифровке механизмов патогенеза заболеваний, вызванных микроорганизмами, роль которых в инфекционном процессе неизвестна или еще недостаточно ясна. Очень важны результаты микробиологической диагностики для эпидемиологической оценки циркуляции возбудителей, проведения активного эпидемиологического надзора за динамикой развития и распространения лекарственной устойчивости микроорганизмов.

Иммунологическая диагностика - лабораторная диагностика, направленная на изучение морфологических и функциональных параметров иммунной системы (иммунного статуса) человека. Все методы иммунологической диагностики можно разделить на методы исследования гуморального иммунитета и методы исследования клеточного иммунитета.

При исследовании гуморального иммунитета определяют содержание в крови всех классов иммуноглобулинов, фракций системы комплемента. В основе методов изучения гуморального иммунитета лежит весьма чувствительная и специфическая реакция «антиген-антитело» с образованием иммунного комплекса. Таким образом, при положительной реакции с известным антителом можно уверенно говорить о наличии соответствующего ему антигена, а при реакции с известным антигеном - о наличии соответствующего антитела. Определяемым результатом образования комплекса «антиген-антитело» может быть конъюгация, преципитация, агглютинация, связывание иммунным комплексом комплемента. Эти явления определяются визуально непосредственно или в результате изменения свойств реагентов (флюоресценции, электропотенциала, вязкости и др.). Реакция конъюгации и преципитации происходит в растворе или геле, для отделения иммунных комплексов в геле применяют электрофорез. Агглютинация оценивается макроскопически. Связывание комплемента определяют при помощи индикаторной системы из эрироцитов барана, связанных с антителами кролика - при наличии гемолиза этих эритроцитов комплемент считается не связанным, а реакция отрицательной, отсутствие гемолиза говорит о связывании комплемента комплексом «антиген-антитело». Также применяют реагенты - антитела или антигены, меченые флюоресцентной, ферментной или радиоактивной меткой, которую потом определяют.

Кроме того, существуют методы исследования гуморального иммунитета in vivo - кожные пробы. Антиген можно вводить внутрикожно или накожно. Проба производится в сравнении с контролем, в качестве которого выступает растворитель. Накожная аппликация антигена дает более надежный и достоверный результат. Реакция на антиген может быть как немедленного типа - через 10-20 минут, так и по типу феномена Артюса - через 2-4 часа, и замедленного типа - через 24-48 часов. Поэтому первичную оценку результата производят через 24 часа, повторную через 48 и 72 часа. Оценка накожной пробы полуколичественная: покраснение - +, покраснение и инфильтрация - ++, покраснение, инфильтрация и пузырьки или некроз - +++.

Клеточный иммунитет изучают путем выделения субпопуляций лимфоцитов методом розеткообразования, реакций связывания меченого флюоресцентной или радиоактивной меткой антигена лимфоцитами, при помощи бласттрансформации после контакта лимфоцита с соответствующим антигеном, определяемой визуально. Функцию лимфоцитов определяют при помощи реакции торможения миграции.

Методы иммунологической диагностики позволяют оценить иммунную систему в норме и патологии, диагностировать аутоиммунные заболевания, сенсибилизацию к аллергену, подобрать совместимую пару донор-реципиент, контролировать подавление иммунитета, осуществлять иммунодиагностику и иммунотерапию опухолей.

Каждого пациента хирургического профиля следует рассматривать как пациента с иммунодефицитом. Угнетению иммунной системы способствует операционный стресс, в генезе которого играют роль такие гормоны, как АКТГ, кортикостероиды и катехоламины. Их выработке способствуют такие неизбежные в хирургии факторы, как психоэмоциональное напряжение, боль, кровопотеря, сама операционная травма. Стресс сопровождается угнетением метаболических процессов во второстепенных системах органов (мышечная, иммунная) в пользу жизненно важных. Кроме того, играют роль в подавлении иммунитета алиментарные ограничения в послеоперационном периоде, фармакологические средства (кортикостероиды, средства для наркоза - барбитураты, фторотан).

Иммунологическая диагностика позволяет количественно оценивать нарушения иммунной системы, сопутствующие хирургической патологии и хирургической агрессии, ставить показания к иммунокоррекции и контролировать ее эффективность.

Контрольные вопросы

1. Что такое микробиологическая диагностика?

2. Каковы задачи микробиологической диагностики, как научного раздела клинической медицины?

3. Классификация и диагностические возможности методов микробиологической диагностики.

4. Принципы интерпретации данных микробиологической диагностики.

5. Что такое иммунологическая диагностика?

6. Каковы задачи иммунологической диагностики, как научного раздела клинической медицины?

7. Классификация и диагностические возможности методов иммунологической диагностики.

8. Принципы интерпретации данных иммунологической диагностики.