6. Протеомика

Функциональная геномика тесно соприкасается и фактически перекрывается с новейшим направлением биологии, получившим название "протеомика" - наука о протеомах. Слово "протеом" образовано от слова "протеин" (белок) и окончания слова "геном", так что в самом названии как бы слиты воедино «белок» и «геном» (ДНК). Это подчеркивает их теснейшую взаимосвязь. Однако, между геномикой и протеомикой, между геномом и протеомом есть одно фундаментальное различие, которое вызывает к жизни совершенно новые ме- тоды исследования, новые стратегии.

Протеом - понятие динамическое, тогда как геном стабилен и постоянен, иначе было бы невозможно передать наследственные свойства от поколения к поколению, обеспечить сохранение видов и т.д. Изменчивость генома всегда происходит на фоне его высокой стабильности и ни в коей мере ее не отменяет. Протеом - набор белков данной клетки в данной фазе ее развития в данный момент времени, т.е. меньше генома по общему объему информации. В любой клетке человеческого организма никогда не функционируют все примерно 80 тыс. генов, работает лишь их часть - иногда меньшая, иногда большая. Хотя точные цифры привести пока трудно, но в обычной специализированной клетке, например, в клетке печени или легкого, одновременно присутствуют, вероятно, не более 10 тыс. белков, причем, в резко различных количествах - от нескольких молекул на клетку до нескольких процентов общего клеточного белка. Набор белков постоянно меняется в зависимости от фазы клеточного деления, тканевой специализации клетки, стадии ее дифференцировки, принадлежности к нормальным или злокачественным клеткам, состояния стресса или покоя, воздействия внеклеточных физиологически активных веществ и так до бесконечности. Поэтому белковый "портрет" клетки зависит от множества факторов и воздействий, подвержен практически непрерывным изменениям, что делает его изучение особенно трудным.

Существует «букет» протеомных технологий; каждая имеет свои достоинства и недостатки. Остановимся на двух, наиболее эффективных. Сложную смесь белков, экстрагированных из клетки, можно подвергнуть разделению на носителе (обычно это полиакриламидный гель) в двух направлениях: в одном-белки будут делиться по размерам (молекулярной массе), в другом - по электрическому заряду (изоэлектрической точке). В результате, получается двумерная, карта, содержащая многие сотни точек, каждая из которых соответствует одному или нескольким белкам.

Если исследователя интересует какая-то группа белков, можно ее выделить на «карте» и подвергнуть повторному разделению в несколько измененных условиях с более высоким разрешением. Сейчас в банках данных хранится информация о множестве разных типов клеток, белки которых были подвергнуты электрофоретическому разделению в двух направлениях. Компьютер умеет сравнивать такие двумерные «белковые карты» и вычленять то, что у этих типов клеток одинаково, а по каким белкам они различаются.

Метод «двумерных карт» непрерывно совершенствуется, и большинство индивидуальных белковых точек, которые видны на этих «картах», уже идентифицированы или находятся в процессе идентификации.

Наиболее современный метод идентификации белков состоит в том, что исследуемый белок подвергают расщеплению на фрагменты (пептиды) с помощью того или иного фермента (протеазы). Затем полученные пептиды разделяют, обычно с помощью хроматографии под высоким давлением, а потом каждый из индивидуальных пептидов помещают в масс-спектрометр и узнают его массу. Сравнение полученных результатов с имеющимися в базах данных по белкам позволяет надежно опознать белок, если его структура известна. Для неизвестного белка этот метод помогает найти "родственников", а следовательно, сформулировать предварительное представление о его возможной функции.

Изменчивость протеома связана не только с тем, что в данный момент времени работает одна часть генов, а в другой момент - иная. Набор белков сильно зависит от процессов, протекающих на пути от ДНК к матричной РНК (мРНК). Здесь большая часть первичных генных продуктов (РНК) подвергается так называемому «альтернативному сплайсингу», суть которого состоит в том, что до образования зрелой матричной РНК из нее удаляются разные части молекулы. В результате, один ген может породить множество белков, различающихся первичной структурой. Таким образом, стало очевидно, что одна из старых догм биохимии и молекулярной биологии - "Один ген - один фермент" - нуждается в модернизации. Для очень многих случаев справедлива формула: "Один ген - много белков".

В этой связи, необходимо отметить, что после синтеза, белки претерпевают множество химических изменений (модификаций), которые создают их огромное разнообразие, хотя исходно они кодированы одним геном. К числу таких модификаций относятся реакции фосфорилирования, ацетилирования, метилирования, гликозилирования и многие другие. Если учесть, что на большом белке есть множество мест, где эти модификации могут происходить, то легко себе представить, какое практически бесконечное разнообразие форм одной и той же белковой молекулы может возникнуть. Подавляющее большинство модификаций существенно сказывается на биологической активности данной молекулы белка, а также на ее способности взаимодействовать с другими белковыми молекулами. В итоге, мы приходим к заключению, что когда в клетке работает, скажем 10% всех генов – допустим, 8 тыс., - то количество разных белков может превысить эту величину в 10 раз. Исследователи и раньше догадывались, что такая ситуация возможна, однако, только теперь реально представляют ее истинные масштабы.

Крайне важным разделом протеомики, безусловно, следует считать изучение белок-белковых и белок-нуклеиновых взаимодействий. В течение жизни клетки практически каждый белок при своем функционировании взаимодействует с множеством макромолекул, а также низкомолекулярных лигандов.

Для изучения белок-белковых взаимодействий в последние годы получил широчайшее распространение метод так называемых «дрожжевых двойных гибридов». С помощью генной инженерии создается конструкция, которая состоит из участка ДНК, взаимодействующего с фактором транскрипции, и участка ДНК, кодирующего «ген-репортер», который в свою очередь кодирует белок-фермент, активность которого легко измерить. Фактор транскрипции состоит из двух доминантов и работает только в том случае, когда доминанты взаимодействуют друг с другом. Если надо узнать, взаимодействуют ли два исследуемых белка друг с другом, нужно отчленить фактор транскрипции и к каждому из доминантов присоединить по интересующему нас белку. При их взаимодействии фактор транскрипции восстановит свою активность, что позволит работать «гену-репортеру», и тогда вы обнаружите активность «репортерного белка». Если исследуемые белки не взаимодействуют, белок-фермент не образуется.

Применение двугибридной системы к белкам человека и других организмов позволило доказать, что существует огромное число белок-белковых контактов самого разного типа и, кроме того, обнаружить множество ранее неизвестных белок-белковых взаимодействий. Эта информация исключительно важна для идентификации компонентов сигнальных путей в клетке. Как правило, в передаче сигналов от поверхности клетки к ядру участвуют «белки-посредники», часто находящиеся в клетке в ничтожных концентрациях, поэтому анализ сигнальных путей для экспериментаторов сильно затруднен. Выявление белок-белковых взаимодействий резко изменило ситуацию.

При анализе белок-нуклеиновых взаимодействий широко используют методы «химической сшивки» этих компонентов (например, сотрудниками академика А.А. Богданова выявлены многие важные взаимодействия внутри рибосомных частиц, где осуществляется биосинтез белков в клетке).

Другой удобный метод - изменение электрофоретической подвижности при комплексообразовании, с помощью которого проанализировано множество ДНК-белковых и РНК-белковых контактов. Оригинальный вариант этого метода в сочетании с «химической сшивкой» разработан академиком А.Д. Мирзабековым и применен для раскрытия структуры нуклеосомы - элементарной структурной единицы, состоящей из ДНК и белков-гистонов, из которых построены все хромосомы.