Marri_i_dr_-_Biokhimia_cheloveka_tom_1

спиралями J3-цепеЙ. Связывание ДФГ осуществля­ ется путем образования солевых мостиков между

атомами кислорода ДФГ и группами, принадлежа­

щими обеим J3-цепям: концевыми аминогруппами

остатков ValNAl, аминогруппами остатков LysEF6

и боковыми группами остатков His Hf1 (рис. 6.17).

Таким образом. ДФГ стабилизирует дезоксиrениро­

ванную Т-форму rемorлобива, образуя поперечныe

связи между Il-цепями- дополнительные солевые

мостики, ко.торые должны быть разрушены при переходе гемоглобина из Т-в R-форму.

С фетальвым гемorлобином ДФГ связывается ме­

нее прочно, чем с гемоглобином взрослого человека,

поскольку в его J3-цепи в положении Н21 находится не His, а Ser, который не может участвовать в фор­ мировании солевых мостиков, удерживающих ДФГ в центральной полости. -Поэтому ДФГ в меньшей

степени способствуют стабилизации Т-формы феталь­

ноrо гемorлобина и последний обладает более высо­

ким сродством к кислороду по сравнению с гемогло­

бином взрослого человека. .

Пусковым механизмом перехрда между R- и Т­ формами reMorлобина служит перемещение атома

железа в плоскость порфириновоrо кольца или от нее.

Источником свободной энергии для этих процессов

(около 3000 кал/моль) служат стерические и электро­

статические факторы.· Таким образом, совсем небо­ льшое смещение атома Fe2+ относительно порфири­

нового кольца вызывает значительные изменения

конформации гемоглобина и решающим образом

воздействует на его ответную реакцию на сигнал, по­

ступающий из внешней среды.

His Н21

Рис. 6.17. Механизм связывания ДФГ с дезоксигемоглоби­ ном человека. ДФГ взаимодействует с тремя положитель­ но заряженными группами ~ каждой из P-uепеЙ..(Из работы

Amone А.: X-ray diffrac110n study of bondl~g of 2.3- diphosphoglycera1e 10 human dеохуhеmоglоЬш. Nature 1972:237: 146, с разрешения.)

Мутантные гемоглобины человека

Мутации генов, кодирующих а- и J3-цепи, могут существенным образом сказываться на их биологи­

ческой функции. Известно несколько сот мутантных

гемоглобинов человека (в большинстве случаев

функционально активных), и о некоторых из них. от­

личающихся сильным изменением биологических

функций, речь пойдет ниже. Патологическое состоя­

ние, при котором мутация вызывает изменение био­ логической функции темоглобина, называют гемо­ l'лобивопатиеЙ.

В семействе rемorлобинов М остатки проксималь­

ноrо или дистальнorо rистидина в а- или Il-

субъединнцах заменены на остатки тирозина. Атом

железа в составе гема находится в этом случае

в Fe3+ -состоянии, что обусловлено образованием

прочного ионного комплекса с фенолятным анио­ ном тирозина. Результатом такой аномалии явля­

ется метгемоглобинемия, поскольку ферри-гем не

способен связывать 02' В а-цепи гемоглобина

М R - Т-равновесие сдвинуто в сторону образова­ ния Т-формы. Сродство к кислороду низкое, эффект Бора отсутствует. В J3-цепях гемоглобинов М может происход~ть переход между R- и Т-состояниями и, следовательно, наблюдается эффект Бора.

Мутации, приводящие к преимущественному

образованию R-формы (в качестве примера можно

привести гемоглобин Чезапик), отличаются тем, что соответствующие гемоглобины обладают повышен­ ным сродством к кислороду. Подобные гемоглобины

не способны поставлять достаточное количество ки­

слорода периферическим тканям. Возникает ткане­ вая гипоксия, ведущая к развитию полицитемии (по­ вышению концентрации эритроцитов).

Гемоглобин при серповидноклеточной

анемии

В гемоглобине S остаток Glu Ai6)J3 замещен на

Val. Остаток А2 (Glu или Val) располагается на по­

верхности молекулы гемоглобина и контактирует

с водой, и замещение полярного остатка Glu на не­

полярный Уаl приводит к появлению на поверхности

J3-субъединицы «липкого участка». Этот липкий уча­

сток присутствует как в оксигенированном, так и

вдезоксигенированном гемоглобине S (в гемоглоби­ не А он отсутствует). На поверхности дезоксиrениро­ ванноrо rемorлобина существует комплементарный

участок, способный прочно связываться с липким участком J3-субъединицы, тогда как в оксигенирован­ ном гемоглобине этот участок маскируется другими группами (рис. 6.18). Когда гемоглобин S переходит

вдезоксигенированное состояние, его липкий уча­

сток \.:вязывается с комплементарным участком на

другой молекуле дезоксигенированного гемоглоби­ на. Происходит полимеризация дезоксиrемorлобина S и е.·о осаждение в виде длинных волокон. Волокна

рованного гемоглобина S (рис. 6.18), но присоедине­

ния «липкого» гемоглобина S к дезоксигемоглобину

А недостаточно для образования полимера, поско­ льку сам дезоксигемоглобин А липкого участка не

содержит и не может связать следующую молекулу

гемоглобина. Следовательно, связывание дезоксиrе­

моглобина А с R- или Т-формой гемоглобина S преры­

вает полимеризацию.

В результате полимеризациидезоксигемоглобина S образуются спиральные фибриллярные структуры.

При этом каждая молекула гемоглобина контакти­

рует с четырьмя соседними молекулами (рис. 6.19).

Образование подобных трубчатых волокон ответ­

ственно за механические нарушения в содержащем

Рис. 6~19. Предполагаемая спиральная структура волокна из агрегированных молекул дезо~сигемоглоб~на S. (Из ра­

боты Maugh Т. 11: А new understanding of sickle се1l emerges.

Sc;ence 1981:211:265, с разрешения.)

их эритроците: он приобретает серповидную форму (рис. 6.20), становится подверженным лизису в мо­

мент прохождения им щелей в синусоидах селезенки.

Талассемии

Другая важная группа нарушений, связанных с аномалиями гемоглобина-таласссмии. Для них

характерна пониженная скорость синтеза а-цепей

гемоглобина (а-талассемия) или р-цепей (р-та­ лассемия). Это приводит к анемии, которая может принимать очень тяжелую форму. В последние годы достигнут ощутимый прогресс в выяснении молеку­

лярных механизмов, ответственных за развитие та­

лассемии (см. гл. 36).

ЛИТЕРАТУРА

Dean J .. Schechter А. N. Sickle-cell anemia: Моlесиlаг and сеl­ lиlаг basis of therapcutic approaches. (3 parts). N. Engl. J. Med., 1978, 299. 752. 804, 863.

Klot;: 1. М.. Наnеу D. N.. КinK L. С. Ra1ional approaches 10 chemotherapy: Antisickling agents. Science. 1981,213. 724.

Perut;: М. F. Hemog10gin structure and respiratory transport. Sci. Аm. (Dec.), 1978, 239, 92.

Perut;: М. F. The rcgu1ation of oxygen-affinity of hemog10bin: IпПиепсс of structure of globin оп heme iron, Аппи. Rev. Biochem.• 1979, 48. 327.

Stamatoyannopoulo.'t G. The mоlеСl1lаг basis of hemoglobin disease. Аппи. Rev. Genet., 1972. 6. 47.

Winslm~' R. М.о .4nderson и/'. F. Thc hemoglobinopathies. Page 1666. In: The Metabolic Basis of Inhcrited Disease. 5th ed., Stanbury J. В. et аl. (eds.), МсGгаw-НiII. 1983.

физические изменения, но по ее завершении возвра­ щaюTcя в исходное состояние. Ферменты являются

белковыми катализаторами биохимических реакций, большая часть которых в отсутствие ферментов про­ текала бы крайне медленно. В отличие от небелко­

вых катализаторов (Н+, ОН -, ионы металлов) каж­

дый фермент способен катализировать лишь очень

небольшое число реакций. часто только одну. Таким

образом, ферменты представляют собой реакционно­

специфические катализаторы. Практическн все биохи­

мические реакции катализируются ферментами.

БИОl\tIЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Ферменты совершенно необходимы для суще­

ствования жизни на Земле. Поэтому неудивительно,

что мы встречаемся с ними во многих областях био­

медицинских наук. Многие болезни (врожденные на­

рушения метаболизма) определяются генетически

обусловленными нарушениями в синтезе ферментов. При повреждении клеток (вызванном, например, H~­ достатком кровоснабжения или воспалением) неко­ торые ферменты попадают в плазму крови. Измере­ ние активности таких ферментов обычно исполь­

зуется для диагностики многих распространенных

заболеваний (например, инфаркта миокарда). Диаг­ ностическая энзимология является областью меди­ цины, использующей ферменты для диагностики

и контроля за результатами лечения. Ферменты при­

тип соответствующей реакции - дегидрогеназы. ок­

сидазы. декарбоксилазы. ацилазы и т. д. Многие из

·этих названий используются и теперь. Номенклатура, введенная Международным био­

химическим союзом (IUB), на первый взгляд кажется

сложной и громоздкой. но зато она является одно­

значной. Главный ее принцип состоит в том, что ферменты называют и классифицируют в соответ­ ствии с типом катализируемой химической реакции

и ее механизмом; это сущес гвенно облегчает систе­

матизаuию данных. огносяшихся к различным

аспектам метаболизма. Основные черты системы,

{Jведенной IUB, состоят в следующем.

1. Реакции и ферменты, которые их катализи­

руют, подразделяются на шесть классов, в кзждом из

которых имеется несколько подклассов (от четырех

до 13).

2. Названне фермента состоит из двух частей: пер­ вая часть-название субстра"fа (или субстратов);

вторая указывает тип катализируемой реакuии и

оканчивается на -аза.

3. ДОПОJlНительная информация. если она необ­

ходима для уточнения, заключается в скобки.

Например, фермент, катализирующий реакцию

L-малат + NADt = Пируват + СО2 + NADH + Н t,

имеет номер 1.1.1.37 и называется L-малат: NAD t

оксидоредуктаза (декарбоксилирующая).

4. Каждый фермент имеет кодовый IIOMep по клас­ сификации ферментов (КФ): первая цифра характери­

. Ниже представлены все шесть классов ферментов

и некоторые конкретные примеры. В скобках указа­

но рекомендуемое название.

1. Оксидоредуктазы.Ферменты,катализирующие

окислительно-восстановительные . реакции с уча­

стием двух субстратов, S и S':

S80CCТ + S'ОI<ИCJ1 = SОI<ИCJ1 + S'8ОССТ.

Катализируют реакции, в которых участвуют такие

ОН (донор электронов). Например:

1.1.1.1. Алкоголь: NAD+ оксидоредуктаза [алко­

гольдегидрогеназа]"

Спирт + NAD+ = Альдегид или кетон +

NADH + Н+.

1.4. Ферменты, действующие на группу CH-NH1 (донор электронов). Например:

1.4.1.3. L-Глутамат: NAD(P)+ оксидоредуктаза

(дезаминирующая) [глутаматдегидрогеназа из пече­ ни животных]. Запись NAD(P)+ означает, что акцеп­ тором электронов может служить либо NAD+ , либо

NADP+.

L-Глутамат + Н2О + NAD(P)+ =

=а-Кетоглутарат + NH"'4 + NAD(P)H + Н+.

2.Трансферазы. Ферменты, катализирующие перенос группы G (отличной от атома водорода)

ссубстрата S на субстрат S':

S-G + S' = S'-G + S.

Катализируют перенос одноуглеродных групп, аль­

дегидных или кетонных остатков, а также ацильных,

алкильных, гликозильных групп и групп, содержа­

щих фосфор и серу. Некоторые подклассы:

2.3. АQИJПрансферазы. Например:

2.3.1.6. Ацетил-СоА:холин О-ацетилтрансфераза [холин-ацетилтрансфераза]

Ацетил-СоА + Холин = СоА + О-Ацетилхолин.

Ацилхолин + Н2О = Холин + Кислота.

3.2. Фермевты, действующие на гJlИКОЗИЛЬНLIе со­ единении. Например:

3.2.1.23. ~-о-Галактозид- галактогидролаза [~­

галактозидаза]

~-D-ГалактозИД + Н2О = Спирт + D-Галактоза.

3.4. Ферменты, действующие на пептидные свизи. Классификация (с подразделением на 11 подклассов)

учитывает различия между пептидазами и протеаза­

ми, выделяет ферменты, гидролизующие дипептиды или более крупные пептиды, отщепляющие одну или

большее число аминокислот, атакующие связь на с­

или N-конце. Протеиназы в соответствии с механиз­

мом катализа подразделяются на сериновые, тиоло­

вые и металлозависимые. Например:

3.4.21. Сериновые протеиназы. Например: химо­

трипсин, трипсин, плазмин, факторы свертывания

крови IXa и XIa.

3.4.23. Карбоксильные (киcлы)) .·протеиназы. На­

пример: пепсины А, В и С.

4. Лиазы. Ферменты, отщепляющие группы от

субстратов по негидролитическому механизму,

собразованием двойных связей.

Ху

I I

С-С = х-у + с = с Ферменты, действующие на связи С-С, С-О, С­

N, C-S и С-галоид. Некоторые подгруппы: 4.1.2. Альдегид-лиазы. Например:

4.1.2.7. Кетозо-l-фосфат-альдолаза [альдолаза]

Кетозо-l-Фосфат = Дигидроксиацетонфосфат +

Альдегид.

4.2. Углерод-кислород лиазы. Например:

4.2.1.2.L-малат- гидро-:лиаза [фумараза] L-малат = Фумарат + Н2О.

5.Изомеразы. В этот класс включены все фер­

менты, катализирующие взаимопревращения опти­

ческих, геометрических и позиционных изомеров.

2.7. ФерментЫ, катализирующие перенос группы,

содержащей фосфор. Например:

2.7.1.1. АТР: D-гексоза 6-фосфотрансфераза [гек­

сокиназа]

АТР + D-Гексоза = АОР + D-Гексозо-6-фосфат.·

3. Гидролазы. Ферменты, катализирующие mд­

ролиз эфирных, сложноэфирных, пептидных и глико­ зильных связей, кислотных ангидридов, связей С­ С, С-галоида и P-N. Например:.

3.1. Ферменты, действующие на СЛОЖНОЭфИРНLIе

свизи. Например:

Некоторые подклассы.:

5.2. Цuс-mранс-изомеразы. Например:

5.2.1.3. все-mранс-Ретиналь ll-цис-mранс-изоме­ раза [ретинальизомераза]

все-mранс-Ретиналь = ll-цис-Ретиналь.

5.3. Ферменты, катализирующие взаимопревраще­

ние альдоз и кетоз. Например:

5.3.1.1. D-Глицеральдегид-3-фосфаткетол-изо- мераза [триозофосфатизомераза]

D-Глицеральдегид-3-фосфат = Дигидроксиаце­ тонфосфат.

6.4. Ферменты, катализирующие образование свизей С-С. Например:

6.4.1.2. Ацетил-СоА:СО2 лигаза (АОР) [ацетил­

СоА- карбоксилаза]

АТР + Ацетил-СоА + СО2 = АОР + Pj +

Малонил-СоА.

КОФЕРМЕНТЫ

Многие ферменты оказывают каталитическое

действие на субстраты только в присутствии специ­ фического термостабильного низкомолекулярного

органического соединения- кофермента. В таких

случаях холофермент (каталитически активный ком­ плекс) состоит из апофермента (белковая часть) и связанного с ним кофермента. Кофермент может

быть связан с апоферментом ковалентными или не­

ковалентными связями. Термин «простетическая

группа» относится к ковалентно связанному кофер­

менту. К числу реакций, требующих присутствия ко­

ферментов, относятся окислительно-восстано­

вительные реакции. реакции переноса групп и изоме­

ризации, а также реакции конденсации (по системе

IUB это классы 1,2,5 и 6). Реакции расщепления, на­

пример гидролитические реакции, катализируемые

пищеварительными ферментами, протекают в от­ сутствие кофермента (по системе IUB это классы 3

и 4).

страт в двух сочетанных реакциях и как переносчик

аминогруппы между различными u-амино- и а­

кетокислотами.

Вторая причина, по которой кофермент можно"

считать равноправным участником реакции, заклю­

чается в том, что именно его участие может иметь

фундаментальное физиологическое значение. Напри­

мер, работа мышцы в анаэробных условиях сопро­

вождается превращением пирувата в лактат. Но

в этом случае важны совсем не лактат и не пируват:

предназначением реакции является превращение

NAOH в NAO+. В отсутствие NAD+ гликолиз про­ должаться не может и анаэробный синтез АТР (а

следовательно, и работа мышцы) прекращается.

Восстановление пирувата до лактата в анаэробных

условиях обеспечивает окисление NAOH в NAO+,

необходимый для синтеза АТР. Функцию образова­ ния NAO+ могут выполнять и другие реакции. Зна­

чение этого процесса становится очевидным, если

перейти от животных к другим формам жизни. у бактерий и дрожжей, растущих в анаэробных

условиях, вещества, образующиеся из пирувата, слу­

жат окислителями дЛЯ NAOH, при этом сами они

восстанавливаются (табл. 7.1).

Таоmща 7.1. Си~тсмы аиа"Jробноii реГСllсраltlш NAD·

Коферменты как вторые субстраты

Кофермент можно рассматривать как второй

субстрат, или косубстрат. по двум причинам. Во­

первых, в ходе реакции кофермент претерпевает хи­

мические изменения, в точности противоположные из­

менениям, которые происходит в субстрате. Напри­

мер, в окислительно-восстановительных дегидроге­

назных реакциях молекула субстрата окисляется,.

а молекула кофермента восстанавливается (рис. 7.1). Подобным же образом в реакциях переаминиро­

вания пиридоксальфосфат выступает как второй суб-

Биохимические реакции переноса можно предста­

вить 8 виде

D-G + А +:t A-G + о.

Здесь функциональная [руппа G переносится от мо­

лекулы донора, D-G, на молекулу акцептора А. Ко­

фермент в этом случае может выступать либо как ко­

нечный акцептор (в реакциях отщепления водорода),

ипантотеноваи кисдота - являются компонентами

коферментов, участвующих в процессах биологиче­

ского окисления и восстановления, а коферментные

формы фолиевой кислоты и кобамида участвуют

.впереносе одноуглеродных фрагментов. Структурным компонентом многих коферментов

является адениновое кольцо, соединенное с о­

рибозой и неорганическим фосфатом. Эти кофер­

На этой схеме показан только один комплекс (СоЕ­

G), но может участвовать и несколько таких проме­

жуточных комплексов.

Если переносимой группой является атом водо­

рода, то обычно указывают лишь левую полуреак­

цию:

D-HX COE

D CoE-Н

Реакции переноса водорода, протекаюшие в жи­

вых клетках (табл. 1.1), идут по схеме

D-HXСоЕ Х А-Н

Можно предложить следующую классификацию коферментов:

Коферменты, участвующие в переносе любых

групп, кро_м-е атомов водорода:

Сахарофосфаты

CoA·SH

Тиаминпирофосфат

Пиридоксальфосфат Фолиатные коферменты

Биотин

Кобамидные (B I2) коферменты

Липоевая кислота

Коферменты, участвующие в переносе атомов водорода:

NAD+, NADP+

FMN, FAD

Липоевая кислота

Кофермент Q

Кофермеиты-производные витаминов группы В и АМР

Витамины группы В входят как составная часть

во многие коферменты. Например, ферменты, участвующие в метаболизме аминокислот, нуждаются

«ТРЕХТОЧЕЧНАЯ ФИКСАЦИЯ» СУБСТРАТОВ

НА ФЕРМЕНТАХ

Большинство субстратов образует по меньшей

мере три связи с ферментом. Благодаря такой «трех­

точечной фиксации» симметричная молекула может

проявлять асимметрию. Чтобы это пояснить, пред­ ставим область фермента, связывающую субстрат,

как участок плоской поверхности (хотя, как мы вско­

ре увидим, субстратсвязывающая «площадка» фер­ мента редко бывает плоской, а возможно, и не бы­

вает совсем). На рис. 1.3 молекула субстрата пред­

ставлена в виде атома углерода с заместителями,

три из которых взаимодействуют с тремя точками

на плоском участке поверхности фермента. Если мо­

лекула субстрата может подойти к этому участку то­

лько с одной стороны и взаимодействовать могут

о

11

GJ'NH'

O---CH1

но ОА

Рис. 7.1.. NAD(P)+; R = Н (в случае NAD+) или

--ОРО2-з(в случае NADP+).

Рис. 7.3. «Трехточечная фиксация» субстрата H~ плоском

активном центре фермента.

только комплементарные структуры субстрата и фермента (в реальных ферментах оба этих условия соблюдаются), то молекула субстрата может связы­ ваться с ферментом единственным способом, даже если группы 1 и 3 идентичны. Перебирая мысленно

все возможные пространственные ориентации моле­

Оптическая специфичность может относиться как

кфрагменту молекулы, так и к молекуле в целом.

Иллюстрацией служит специфичность гликозидаз. Эти ферменты катализируют гидролиз гликозидных

связей между сахаром и спиртовой группой: ОIlИ вы­

сокоспецифичны как к сахарному фрагменту, так и

кхарактеру гликозидной связи (а или ~), но относи­

тельно неспецифичны к спиртовому фрагменту мо­

лекулы.

кулы субстрата, мы можем убедиться, что с тремя точками плоской поверхности (с одной и той же сто­ роны) молекула может связаться только в одной ориентации. Отсюда следует, что группы 1 и 3, хотя они и идентичны, при связывании с ферментом ста­

новятся неэквивалентными из-за различия в их окру­

жении. Химические изменения будут происходить только С группой 1, но не с группой 3 (или наоборот). Обобщая эти рассуждения, мы можем объяснить

теперь, почему ферментативное восстановление оп­

тически неактивного пирувата приводит к образова­ нию именно L-, а не О, L-лактата.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ

ГруппоспеЦИфИIIНОСТЬ ферментов

Литические ферменты действуют на специфиче­

ские химические группировки: гликозидазына

гликозидные связи, пепсин и трипсин - на псптид­

ные связи, эстеразы- на сложноэфирные связи. Дей­

ствие этих ферментов распространяется на большое число субстратов, что позволяет организму обой­ тись небольшим числом пищеваритеЛЬЩ,lХ фермен­

тов - иначе их потребовалось бы намного больше.

Многие протеазы способны также катализировать гидролиз сложных эфиров. Хотя способность про­ теаз гидролизовать сложноэфирные связи не имеет физиологического значения, использование сло­

Способность фермента катализировать одну и то­

лько одну специфическую реакцию является, пожалуй,

наиболее важным его свойством. Благодаря этому

скорости специфических метаболических процессов

могут регулироваться путем изменения каталитиче­

ской активности специфических ферментов. Правда,

многие ферменты катализируют реакции одного ти­ па (перенос фосфата, окислительно-восстано­

вительные реакции и т. д.), субстратами при этом

является небольшое число структурно сходных со­

единений. Реакции с альтернативными субстратами

происходят в тех случаях, когда эти субстраты при­ сутствуют в высоких концентрациях. Протекают ли

жноэфирных синтетических субстратов для изучения

механизма их действия оказалось весьма ценным.

Отдельные литические ферменты отличаются бо­

лее высокой группоспецифичностью. Так, химотрип­

син гидролизует преимущественно пептидные связи,

в которых карбоксильная группа принадлежит аро­

матическим аминокислотам - фенилаланину, тиро­

зину или триптофану. Карбоксипептидазы и амино­

пептидазы отщепляют аминокислоты по одной

с карбоксильного или с амино-конца соответствен­

но.

Некоторые оксидоредуктазы способны использо­

вать в качестве акцепторов электронов и NAD+, и

сравнивают относительные количества фермента

в различных экстрактах. Единицы активности удоб­

нее всего выражать в микромолях (мкмоль, 10-6 моль), наномолях (нмоль, 10-9 моль) или пикомолях

(пмоль, 10-12 моль) израсходованного субстрата или образовавшегося продукта за единицу времени (в

минуту). С(ютветствующие международные едини­

цы активности ферментов обозначаются ....U, nU или

pU.

"ример количествеииого анализа

ферментативной активности;

определение содержания дегидрогеназы

При измерении скоростей реакций, протекающих

с участием NAD+ или NADP+ (реакции катализи­ руются дегидрогеназами), можно воспользоваться тем обстоятельством, что NADH и NADPH (но не NAD.f- и NADP+) поглощают свет с длиной волны

340 нм (рис. 7.4).

Окисление NADH в NAD+ (или обратный про­

цесс) сопровождается изменением оптической плот­ ности (D) растворов при 340 нм, и при определенных

условиях скорость изменения D оказывается пропор­

циональна активности фермента (рис. 7.5).

Для получения калибровочной кривой (рис. 7.6)

строят график зависимости скорости изменения оп­

тической плотности (наклона прямых на рис. 7.5) от

объема добавленного ферментного препарата. Ко­

личество фермента. присутствующего в исследуе­

мом растворе, можно найти по наблюдаемой скоро­ сти изменеJ.IИЯ D при 340 нм.

В предыдущем примере оценка ферментативной

активности основывалась на измерении скорости

образования продукта (NADH). Скорость образова­

ния продукта (или, реже. скорость расходования суб-

::а:

ж

~~ 0,85

с:

Q

0.80

NАDРН-зависимой дегидрогеназы. измсrяют скорость из­ менения оптической плотности при 340 нм. обусловленного

превращением восстановленного кофермента в окислен­

ную форму. В кювету добавляют окисленный субстрат (S). восстановленный кофермент и буфер и регистрируют по­ Г.l0шение при 340 нм. Вначале наблюдается высокая опти­ ческая плотность Иl-за сильного по••10щения NADH (ИJ1И NADPH). При добавлении 0.025- 0.2 мл станл.артнOJ-О ра-

СТ80ра фермента оптическая плотность понижается.

Рис. 7.6. Калибровочная кривая для определения количе­ ства фермента_ ПО ОСИ ординат ОТ!IOжен тангенс угла на­

клона прямых, нриведенных на рис_ 7.5, по оси абсцисс-

КО;IИчество фермента_

страта) можно использовать для определения актив­

ности не только дегидрогеназ, но и других фермен­

тов. Конкретный метод количественной оценки дик­

туется физико-химическими свойствами продукта

или субстрата. Во многих случаях бывает удобно подвергать образоваВlllИЙСЯ продукт реакции дей­

ствию дегидрогеназы, для которой этот продукт

является субстратом (рис. 7.7).

Глюкоза

~ДTP,Mg2+

Гексокиназа

~ДDP,M92+

Гпюкозо·6-фосфIlТ

Гпюкозо-6-фосфатдегидрогенаЗII

NADPH+ н+

6-ФосфоГПЮКОНОПIlКТОН

Рис. 7.7. Определение активности гексокиназы в системе, в которой протекает сопряженная ферментативная реак­ иия, катализируемая глюкозо-6-фосфатдегидрогсназоЙ.

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глюкоза, АТР, Mg2 + и

NADpt добавлены в избытке. В "Этих ус..l0ВИЯХ скорость

общей сопряженной реакции зависит от количества добав­

:Iенной гсксокиназы. Эту скорость опрсде_1ЯЮТ по образо-

ванию NADPH, который поглощает свет при 340 нм.

молекулы удаляются диализом или гель­

фильтрацией; нуклеиновые кислоты- осаждением

путем доб~вления антибиотика стрептомицина

и т.д. Основная проблема-отделить нужный фер­ мент от сотен химически и физически сходных бел­

ков.

I(лассические MeTO~ очистки

Широко используются следующие методы очист­ ки: осаждение при различных концентрациях солей

(чаще всего сульфата аммония или сульфата на­

трия), а также органическими растворителями (аце­ тоном, этанолом); дифференциальная денатурация путем нагревания или изменения рН; дифферен­

циальное центрифугирование, гель-фильтрация

и электрофорез.

Для маСlllтабной и быстрой очистки белков

успеlllНО применяются избирательная адсорбция

и элюция белков с целлюлозного анионообменника

диэтиламиноэтилцеллюзлозы и катионообменника

карбоксиметилцеллюлозы. Широко используется

также разделение белков по размерам на молекуляр­

ных ситах, например сефадексе. Эти методы явля­ ются, однако, относительно малоселективными (если они не используются в сочетании) для отделения ин­

дивидуального белка от всех остальных, находя­ щихея в смеси. Такая задача легче реlllается методом аффинной хроматографии.

Типичная процедура очистки одного из ферментов печени с ХОРОlllИМ выходом И 490-кратной степенью

очистки препарата описана в табл. 7.2. Обратите

внимание на изменение при очистке удельной актив­

ности и выхода фермента. Процедура направлена на то, чтобы достичь максимальной удельной активно­

сти (число единиц активности фермента на 1 мг бел­

ка) при возможно БолыllмM выходе исходной сум­

марной активности.