Marri_i_dr_-_Biokhimia_cheloveka_tom_1

ния (при разделении аминокислот используют обра­ ботку О.5%-ным нингидрином В ацетоне с последую­

щим прогреванием в течение нескольких минут при

90-J100). Аминокислоты с объемными неполярны­

ми боковыми цепями (Leu, IIе. РЬе, Trp. Val, Met. Tyr) перемещаются быстрее, чем аминокислоты с более короткими неполярными боковыми цепями (Pro, Ala, Gly) или с полярными боковыми цепями

(Thr. Glu. Ser. Arg, Asp. His, Lys, Cys) (рис. 3.10). Это

обусловлено большей растворимостью полярных молекул в гидрофильной стационарной фазе и непо­ лярных - в органических растворителях. Отметим, что в ряду неполярных аминокислот (Gly, Ala, Val, Leu) при увеличении длины неполярной боковой це­

пи, сопровождающемся усилением ее неполярного

характера. увеличивается и подвижность аминоки­

слоты.

Отношение расстояния, на которое перемещается данная аминокислота. к расстоянию, пройденному

фронтом растворителя (оба они отсчитываются от точки нанесения смеси аминокислот), обозначают

через Rr (подвижность по отношению к фронту ра­

створителя). Значение Rr для данной аминокислоты

зависит от условий эксперимента, например от типа

известной смесью проводить хроматографирование известной стандартной смеси аминокислот. В этом случае подвижность исследуемой аминокислоты мо­

жно отнести к подвижности стандарта (например, не Rr, а RA,a). Подвижности. выраженные относительно

стандарта. меняются от эксперимента к эксперимен­

ту в меньшей степени, чем Rr•

Для количественного анализа аминокислот каж­

дое пятно вырезают и элюируют (вымывают) веще­

ство подходящим растворителем; затем проводят

количественный колориметрический (нингидрино­

вый) анализ. В другом варианте бумагу опрыски­

вают нингидрином и измеряют с помощью фотоме­

тра интенсивность окрашивания пятна в проходя­

щем или отраженном свете.

При двумерной хроматографии на бумаге образец

наносят на один из углов квадратного листа бумаги

и проводят разделение в одной системе растворите­

лей. Затем лист вынимают, высушивают, поворачи­ вают его на 900 и хроматографируют в другом ра­ створителе (рис. 3.11).

Тонкослойная хроматография

Бут.нол/уксусная кислота/вода (4:1 :5)

2... ТО"К8 • . Asp

он.несенИR

Рис. 3.11. Двумерная хроматограмма аминокислот, вхuди­

щих в состав белка (воспроизведена с некоторыми модифи­

кациями из работы Anal. Chem. 1953:25:396).

пределительной хроматографией на бумаге. а ад­ сорбционная тонкослойная хроматография (Атех)

основана на совершенно иных принц~пах.

собностью растворителя (этот растворитель не обя­ зательно является бинарной или более сложной смесью) элюировать компоненты образца с места его

адсорбции на активированном сорбенте, например на нагретом силикагеле. Атех применима для раз­

деления таких неполярных соединений, как липиды•

но не для разделения аминокислот и большинства

пептидов.

Автоматическая ионообменная хроматография

Разделение аминокислот можно проводить раз­

ными методами, но для анализа аминокислотного

состава полипептида после его гидролиза обычно

используют автоматическую ионообменную хромато­

графию. Полное разделение аминокислот, их иденти­

фикация и количественная оценка занимают менее

трех часов. В методе Мура и Штейна используют ко­

роткую и длинную колонки, заполненные смолой из

сульфонированного полистирола в Nа+-форме. Ког­ да кислотный гидролизат при рН 2 наносят на ко­

лонку, аминокислоты связываются в результате ка­

тионного обмена с Na +. Далее колонку элюируют

раствором цитрата натрия при заранее запрограм­

В биохимии широкое применение нашло разделе­ ние аминокислот, полипептидов и дрyrих амфоли­

тов (молекул, суммарный заряд которых зависит от рН среды) под действием наложенного постоянного электрического поля. При разделении аминокислот в качестве инертных носителей чаще всего исполь­

зуют полоски бумаги или тонкие слои целлюлозного порошка. Разделение проводят в течение 0,5-2. ч при

напряжении 2000-5000 В в зависимости от суммар­ ных зарядов амфолитов и их молекулярных масс.

Среди молекул, несущих одинаковый заряд, более легкие мигрируют быстрее. Но более важным пара­

метром при разделении является суммарный заряд.

Методприменяется для разделения аминокислот,

низкомолекулярных пептидов, некоторых белков,

нуклеотидов и сахарофосфатов. Образец помещают

на носитель, смачивают буфером при соответствую­ щем рН и соединяют с буферным резервуаром поло­ ской фильтровальной бумаги. Бумагу прикрывают стеклянной пластинкой или погружают в углеводо­ родный растворитель для охлаждения. В электриче­

ском поле молекулы, несущие при данном рН отри­

цательный заряд, мигрируют к аноду, а те, которые несут положительный заряд,-К катоду. Далее высу­ шенную электрофореграмму «проявляют» нингид­ рином (при работе с аминокислотами, пептидами)

или измеряют поглощение в Уф-свете (при работе

с .нуклеотидами).

си. При рН 6,4 глутамат и аспартат несут заряд - 1

и движутся к аноду; разделение их осуществляется

благодаря различию в молекулярной массе. Лизин,

аргинин и гистидин движутся В противоположном

направлении, а все дрyrие аминокислоты, входящие

в состав белка, остаются вблизи места нанесения. При разделении пептидов, образовавшихся в резуль­

тате ферментативного расщепления, уменьшение рН до 3,5 приводит к увеличению заряда катионных

групп и обеспечивает лучшее. разделение.

ЛИТЕРАТУРА

Barrett G. С. Chcrnistry and Biochernistry of the Arnino Acids, Chaprnan and НаН, 1985.

Соорег Т. G. ТЬе Tools· of Biochernistry, Wiley, 1977. Friedman М. ТЬе Chernistry and Biochernisrty of the Sulfhydryl

Group in Arnino Acids. Peptides, and Proteins, Pergamon Press, 1973.

Greenstein J. Р., Winitz М. Chernictry of the Arnino Acids, 3 vols, Wiley, 1961.

Heftman Е. Chrornatography: А Laboratory Handbook of Chrornatographic and Electrophoretic Methods, 3rd ed.,

БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Пептиды имеют очень большое биомедицинское

значение; особенно велика их роль в эндокриноло­

гии. Пептидами являются многие важнейшие гормо­

ны человека. Их часто назначают больным для кор­

рекции соответствующей недостаточности. Самый известный пример- введение инсулина больным са­ харным диабетом. Пептидами являются также раз­ личные антибиотики (валиномицин, грамицидин А)

и некоторые противоопухолевые препараты (напри­

мер, блеомицин). Разработанные в последние годы

методы быстрого химического синтеза пептидов по­

зволили наладить производство пептидных гормо­

нов в значительных количествах; это разрешило

многие проблемы, поскольку обычно гормоны при­ сутствуют В организме животных в очень' малых

концентрациях и их трудно выделить в количествах,

Рис. 4.1. Структурная фОРМУ.1а трипептида. Пептидные

связи для наглядности затенены.

изображать так, чтобы N-КOIщевой остаток (содер­ жащий свободную а-аминогруппу) располarался сле­ ва, а C-КOIщевой остаток (со свободной а­ карбоксильной группоЙ)-справа. Такой пептид

имеет тольке одну свободную а-аминогруппу и толь­ ко одну а-карбоксильную группу. Это справедливо

для всех полипептидов, которые образованы только

аминокислотными остатками, соединенными друг

с другом пептиДНЫМИ связями, образовавшимися

между а:-аминогруппой и а-карбоксильной группой.

В некоторых пептидах концевая аминогруппа или

концевая карбоксильная группа модифицирована

(примером могут служить ацильное производное аминогруппы или амид карбоксильной группы) и,та­

ким образом, не является свободной.

достаточных для терапевтических целей. По той же

технологии осуществляется синтез и других пепти­

дов, которые ввиду их малого содержания тоже

трудно выделять из природных источни(юв; в част­

ности, это относится к вирусным пептидам, исполь­

зуемым в качестве вакцин.

СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ,

Общие сведения о структуре пептида

На рис. 4.1 изображен трипептид, состоящий из

аминокислотных остатков аланина, цистеина и вали­

на. Отметим, что трнnептнд содержит три остатка, но

не три пеПТндНые связи. Структуру пептида принято

Запись структурной формулы пептидов

Укажем самый простой способ записи. 80-

первых, нарисуем «остов» ИЗ связанных друг с дру­

гом a-NH2- и а-СООН-групп и из атомов а­

углерода. Эти группы чередуются вдоль остова це­

пи. Затем подсоединим к а-углеродным атомам со­ ответствующие боковые группы. Опишем эту проце­

дуру подробнее.

1. Вычертим зигзагообразную линию произво­ льной длины И добавим слева N-концевую амино­

группу:

+н3 N

3. Присоединим соответствующие R-группы (они затенены) и атомы а-водорода к а-углеродным ато­

мам:

Glu-Ala-Lys-Gly-Tyr-Ala

Е А К G У А

Рис. 4.2. ПрсдстаВ.lение псрвичной С1РУКТУРЫ гсксапепти­

да с ПО;\-ЮЩЬЮ трехбуквенных и однобуквенных обозначе­

ний аМИНОКИС.l0ТНЫХ остатков. Данный гексапептид содер­

жит Н<1 N-КОНItС fJ....yTaMaT (Glu. Е). а на С-конце <1лаНJlН

(Ala, Л).

Первичная структура пептида

Линейная последовательность аминокислотных

остатков в полипептиДНОЙ цепи называется первич­

ной структурой пептнда. Чтобы определить первич­

ную структуру ttолипептида, нужно установить

число, химическую структуру и поридок расположе­

нии всех аминокислотных остатков, входящих в его

состав.

Полипептиды (белки) могут содержать 100 и бо­

лее остатков, поэтому традиционные структурные

формулы оказываются неудобными для представле­ ния первичной структуры. «Химическая скоропись» использует либо трехбуквенные, либо однобуквен­

ные обозначения аминокислот, выписанные во вто­

ром столбце табл. 3.3 (рис. 4.2). При наименовании пептида его рассматривают как производное с­

концевого аминокислотного остатка.

Если первичная структура однозначно установле­

на, то трехбуквенные обозначения аминокислотных

остатков соединяют черточками. Однобуквенные обозначения черточками не соединяют. Если на ка­ ком-то участке полипептидной цепи точный порядок

следования аминокислотных остатков неизвестен,

эти остатки заключают в скобки и разделяют запя­ тыми (рис. 4.3).

~изиологические последствия изменений

в первичной структуре

Замена всего одной аминокислоты на другую

в линейной последовательности из 100 и более ами­

нокислот может привести к снижению или полной

потере биологической активности пептида, а это повлечет за собой весьма серьезные последствия (в

качестве примера можно привести серповиднокле­

точную анемию; см. гл. 6). Многие наследуемые на­ рушения метаболизма обусловлены именно одиноч­

ными заменами такого типа. С развитием новых

мощных методов определения структуры белков

и ДНК удалось выяснить биохимическую основу

многих наследуемых болезней, связанных с наруше­

ниями метаболизма:

ИОННЫЕ ФОРМЫ ПЕШИДОВ

Пептидная (амидная) группа остается незаряжен­

ной при всех физиологических значениях рН. Обра­

зование пептида из аминокислот при рН 7,4 сопрово­ ждается потерей одного отриuательного и одного положительного заряда на каждую образовавшуюся пептидную связь. Однако пептиды при физиологиче­ ских рН несут суммарный заряд, поскольку заряжен­ ными являются с- и N-конuеВbIе группы и связанные

с а-углеродными атомами заряженные боковые цепи

Полипептиды, так же как аминокислоты и другие

заряженные молекулы, можно выделить с помощью

методов, основанных на разделении по заряду (элек­

трофорез, ионообменная хроматография). Значение рК С-концевой карбоксильной группы полипептида

выше, чем у а-карбоксильной группы соответствую­ щей аминокислоты (т.е. пептидшtя СООН­

группа- более слабая кислота). Протонированная N-концевая аминогруппа, напротив, является более

сильной кислотой (с более низким 'значением рк), чем аминогруппа соответствующей свободной ами­

нокислоты, от которой она произошла (табл. 4.1).

Таб.'1иuа 4.1. Значения рЛ·;t.ГJЯ ГЛlПЩШl и Г.lIЩИIЮВЫХ пеrни-

ДОА

КОНФОРМАЦИЯ ПЕПТИДОВ В РАСТВОРЕ

Теоретически пептид может находиться в самых

разнообразных конформационных состояниях (т. е.

иметь множество вариантов пространственного ра­

сположения атомов). Однако, судя по имеющимся данным, в растворе диапазон возможных конформа­ ций невелик. Наличие преимущественных конформа­

ций обусловлено такими факторами, как стерические ограничения,кулоновскиевзаимодействия,ВОДОРОД­

ные связи и гидрофобные взаимодействия (гл. 5).

Как и в случае белков, физиологическая активность

полипептидов (например, ангиотензина и вазопрес­

сина) тоже зависит от их конформации (гл. 45, 48).

Физиолоrически активные пептиды

Животные, растительные и бактериальные клет­

ки содержат множество разных полипептидов (от

3 до 100 аминокислотных остатков), обладающих высокой физиологической активностью. Некоторые из них, в частности большинство полипептидных

гормонов млекопитающих, содержат только пеп­

тидные связи, образованные между а-амин0- и а­ карбоксильной группами двадцати L-

а-аминокислот, входящих в состав белков. Однако

в полипептидах (но не в белках) могут содержаться и другие аминокислоты или производные обычных,

встречающихся в белках, аминокислот. Приведем

несколько примеров такого рода.

Короткие полипептиды брадикинин и каллидин вызывают расслабление гладких мышц и являются

продуктами ограниченного протеолиза специфиче­

ских белков плазмы. Поскольку эти пептиды проис­

ходят из белков, они содержат только аминокисло­

ты, встречающиеся в белках:

Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg

Брадикинин

Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg

тион вместе с ферментом глутатионредуктазой уча­

ствует в образовании «правильных» дисульфидных

связей во многих белках и полипептидных гормонах

(гл. 5).

Полипептидные антибиотики, синтезируемые грибами, часто содержат как О-, так и L-

аминокислоты, а также некоторые аминокислоты, не

встречающиеся в белках. Примерами могут служить

тироцидин И грамицидин S - циклические полипеп­

тиды, содержание D-фенилаланин и «небелICОВУЮ) аминокислоту орнитин. Синтез этих полипептидов

осуществляется не в рибосомах.

Еще одним примером служит тиреолиберин (рис. 4.5). Его N-концевой глутамат циклизован с образо­ ванием остатка пироглутаминовой кислоты, а С­ концевая карбоксильная группа пролина амидирова­

на.

NVNH ~Hz

Рис. 4.5. Тиреолиберин (пироглутамилгистидилпролин­

амид).

в организме млекопитающих синтезируется по­ липептид, включающий несколько полипептидов,

потенцщlЛЬНО обладающих физиологической актив­ ностью. I3-Липотропин- гипофизарный гормон, стимулирующий освобождение жирных кислот из

жировой ткаНИ,-содержит аминокислотные после­

довательности, идент~чные последовательностям

некоторых других полипептидных гормонов с иной физиологической активностью (рис. 4.6). Это! высо­

комолекулярный полипептид служит предшествен­

ником полипептидов меньшего размера.

Каллидин

Глутатион (рис. 4.4) встречается во всех видах ор­

ганизмов; это атипичный трипептид, в котором N- концевой глутамат и цистеин связаны не а­ пептидной связью. В организме человека и других животных глутатион необходим для работы ряда

ферментов. По имеющимся представлениям, глута-

H-С-NНз+

I

соо-

Рис. 4.4. Глутатион ('У-глутамилцистеинилглицин).

МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ ПЕПТИДОВ

Хроматография и высоковольтный электрофорез

Эти методы (гл. 3) применимы для разделения не

только аминокислот, но и низкомолекулярных поли­

пептидов.

Ге.'1Ь-фИЛЬтрация

При автоматическом секвенировании (определе­

нии аминокислотной последовательности) исполь­

зуют крупные (30-100 остатков) пептиды. Однако

многие денатурированные высокомолекулярные по­

липептиды оказыватся нерастворимыми. Это связа­ но с тем, что гидрофобные остатки, ранее укрытые

внутри молекулы, при денатурации могут экспони­

роваться. Такие полипептиды можно в принципе ра­

створить в мочевине, спиртах, органических кисло­

тах и основаниях, но это ограничивает возможности

последующего разделения пептидов с помощью ио­

нообменной хроматографии. Впрочем, гель­ фильтрацию крупных гидрофобных пептИДОВ можно

проводить в 1--4 М муравьиной или уксусной кисло­ те (рис. 4.7).

Жидкостная хроматография на колонках с обращенной фазой при высоком давлении

а также полимер акриламида (СН2= CH·CONH2) с

поперечными сшивками. Если электрофорез проводи­

ТСН в полнакрнламндном геле (ПАГ), то раствор бел­

ка наносят на насыщенные буфером блоки поли­ акриламИда. «прошитого» метиленбисакриламидом

(<<бис») (степень сшивания 2-10%) ил~ другим ана­

логичным сшивающим реагентом. Для проявления

используют кумасси синий или Ag+ (полипептиды), бромистый этидий (полинуклеотиды) и т. Д. Весьма

распространено использование электрофореза в по­

лиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Белок прогревают и затем проводят электрофорез

в присутствии денатурирующих агентов - моче­

Мощным методом очистки высокомолекуляр­

ных неполярных пептидов является жидкостная хро­

матография при высоком давлении на неполярных

материалах с использованием для элюирования по­

лярных растворителей. Рис. 4.8 иллюстрирует разде­

ление с помощью этого метода тех же бромциано­

вых фрагментов фетального rлобина человека, кото­

рые фигурировали на рис. 4.7. Совместно используя

гель-фильтрацию и указанный метод, можно разде­

лить сложные смеси пептидов, полученные путем ча­

стичного протеолиза. Для разделения крупных пеп­

тидов созданы новые стационарные фазы.

Высоковольтный электрофорез

на молекулярных ситах

В этом методе используются одновременно

и разделение по заряду, и эффект молекулярного си­

та. В качестве сита применяют крахмал и d-гарозу,

вины или додецилсульфата натрия (ДСН), чтобы

создать условия, благоприятные для разделения

молекул по размеру. Электрофорез в ЛАг-Ден ши­

роко используется для определения молекулярной

массы белковых субъединиц; метод основан на срав­

нении их подвижности с подвижностью стандартных

препаратов известной молекулярной массы.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА ПЕПТИДОВ

Прежде всего путем гидролиза разрушают пеп­

тидные связи. Поскольку ·при нейтральных рН пеп­

тидные связи стабильны. применяют кислотный или щелочной катализ. Ферментативный катализ для полного гидролиза менее пригоден. Полный гидро­ лиз белка на составляющие аминокислоты неизбе­

жно сопровождается частичной потерей некоторых аминокислотных остатков. Лучше всего проводить

t--

Об1оем. проwедwий через гель. мл

Рис. 4.7. Гель-фильтрация бромциановых (СВ) фрагментов фетального глобина человека. Хроматография проведена

на колонке сефадекс а-50. уравновешенной IO/o-ным

НСООН, с последующей 'ЭЛЮl1ией тем же раствором. Ну­

мерация фрагментов а- и у-цепей произвольна. (С любезно­

го разрешения J. D. Pearson е! al., Department оГ Biochemistry, Purdue University.)

гидролиз в 6 н. HCl при 110°С в вакуумированной

ампуле. В этих условиях полностью разрушаются триптофан }_ цистеин и частично цистин. В присут­ ствии металлов наблюдается частичная потеря ме­

тионина и тирозина. Глутамин и аспараrин количе­ ственно дезамидируются в глутамат и аспартат. Со­

держание серина и треонина тоже оказывается зани­

женным, причем в тем большей степени, чем дольше

проводится гидролиз. Наконец, некоторые сqязи ме­

жду нейтральцыми остатками (Val-Val, Ilе-Ilе, Val-

Ilе, Ilе-Val) даже через 20 ч гидролизуются лишь на 50%. Обычно параллельные пробы гидролизуют в тече,ние 24, 48, 72 и 96 ч. Затем данные по серину и треонину наносят на график в полулогарифмиче­

ском масштабе и проводят экстраполяцию к нулево­ му моменту времени. По валину и изолейцину испо­

льзуют результаты, полученные при 96-часовом гид­

ролизе. Дикарбоновые кислоты и их амиды опреде­

ляются суммарно и регистрируются как "Glx" или

.,Asx". Цистеин и цистин до гидролиза превращают

Рис. 4.8. Жидкостная хроматография с обращенной фазой

при высоком давлении: профиль 'Элюирования бромциано­

вых (СВ) фрагментов фетального глобина человека. Нуме­

рация фрагментов а- и у-цепей произвольна. (С любезного

разрешения J. D. Pearson ct al., Department оГ Biochemistry, Purdue University.)

в кислотостабильные производные (например, в цистеиновую кислоту). Для анализа триптофана проводят щелочной гидролиз; при этом происходят

разрушение серина, треонина, аргинина и цистеина

и рацемизация всех аминокислот. По окончании гид­ ролиза аминокислотный состав можно определить с помощью автоматической нонообменной хромато­

графин (см. рис. 3.12) или жидкостной хроматогра­

фии под давлением.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТ;РУКТУРЫ

ПОЛИПЕПТИДОВ

Уже более трех десятилетий минуло с тех пор, как

Сенгер поразил биохимический мир, установ"в с по­

мощью химических и ферментативных методов пол­ ную первичную структуру гормона инсулина. Под-

-ход Сенгера состоял в следующем. Сначала он раз­

делил две полипептидные цепи инсулина, А и В, и да­ лее провел их специфическое ферментативное расще-

пление на небольшие пептиды, содержащие перекры­

вающиеся участки последовательности. Он разделил

фтор-2,4-динитробензол (рис. 4.9), идентифицировал их N-концевые остатки. Кроме того, он определил

аминокислотный состав пептидов и в итоге смог

установить их структуру. Сравнивая последователь­

ности перекрывающихся пептидов, он однозначно

установил первичную структуру обеих цепей, А и В. В общих чертах стратегия Сенгера сохранила

свое значение и до наших дней, однако за истекшие десятилетия бьши разработаны два новых подхода,

которые произвели революцию в определении пер­

вичной структуры полипептидов (белков). Первый подход основан на разработанной Эдманом в 1967 г.

автоматической процедуре последовательного от­ щепления и идентификации N-концевых аминоки­ слотных остап<"Ов в виде их фенилтиогидантоиновых

производных. Второй подход связан с методом, раз­

работанным Сенгером и, независимо, Максамом

и Гилбертом, позволяющим проводить быстрое

иоднозначное секвенирование гена, кодирующего

рассматриваемый белок. Оптимальная стратегия со­

стоит в одновременном ~спользовании обоих подхо­ дов. Автоматическая деградация по Эдману, намно­

го более быстрая по сравнению с первоначальным ручным методом CeHгepa~ тем не менее сильно усту­ пает по скорости методам секвенирования ДИК и сопряжена с рядом трудностей. С другой стороны, секвенирование ДНК не всегда дает однозначную

первичную структуру исследуемого белка. Главным

в честь нобелевского лауреата (1958 г.) биохимика Фреде­

рика Сенгера. который использовал его для определения первичной структуры инсулина. Вначале арилируют (с количественным выходом) всех свободные аминогруп­ пы. после гидролиза пептида образуются 2,4- динкrрофенил-производные аминокислот. обладающие яркой желтой окраской. Количественный анализ этих про­

изводных осуществляют спектрофотометрическими ме­

тодами. С динитрофторбензолом реагируют также

с-аминогруппа лизина, имидазольная группа гистидина,

ОН-группа тирозина и SН-группа цистеина. Динитрофе­

нильные группы не отщепляются при кислотном гид­

ролизе и используются для идентификации N-конuеВblХ

осложнением при секвенировании эукариотических

генов является присутствие внутри гена ННТРОНОВ (гл.

38), которые не считываются в ходе экспрессии и не представлены в зрелом белке. В то же время боль­ шим преимуществом метода секвенирования ДНК

является относительная легкость обнаружения и се­

квенирования участков, присутствующих только

в предшественнике белка и отщепляемых при его со­ зревании. Таким образом, секвенирование ДИК

иавтоматическая процедура Эдмана дополняют

друг друга; их совместное использование коренным

образом изменило'и расширило наши знания о пер­

вичной структуре белков. Секвенирование ДНК мы рассмотрим 8 гл. 38, а процедуру Эдмана-в сле­

дующем разделе.

АВТОМАТИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

АМИНОКИСЛОТНОЙ

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИПОЛИПЕПТИДОВ

МЕТОДОМ ЭДМАНА

Разделение на линейные полипептиды

Молекулы многих белков содержат более одной полипептидной цепи; эти цепи связаны либо некова­ лентными связями, либо дисульфидными мостика­ ми. Поэтому первым шагом должно быть выделение

индивидуальных полипептидных цепей. Диссоциа­

цию нековалентно связанных полипептидов проВО­

дят с помощью денатурирующих агентов (мочеви­

ны, гуанидингидрохлорида). которые разрывают во­ дородные связи. Дисульфидные мостики разрушают

с помощью окисляющих и восстанавливающих аген­

тов (рис. 4.10). Затем проводят хроматографическое

разделение полипептидов.

Расщепление полипептида на фрагменты,

пригодные для автоматического

секвенирования

Приборы для автоматического секвенирования (секвенаторы) работают наиболее эффективно, ког­ да длина полипептидов составляет 20---60 остатков. Эти требования в значительной мере способствова­

ли разработке методов расщепления полипептидов

на фрагменты нужного размера и их очистки. Основ­

ной задачей стало не получение большого числа ма­

лых фрагментов, пригодных для ручного секвениро­

вания, а расщепление на малое число крупных фраг­

ме-нтов (от 30 до 100 остатков). При этом желатель­

но было осуществить полное высокоспецифичное расщепление по ограниченному числу связей. Этим требованиям отвечает расщепление цианогенброми­ дом (CNBr), трипсином и о-иодозобензолом.

А. CNBr. Предварительно проводят модифика­ цию остатков цистеина иодоуксусной кислотой. Да­

лее с помощью CNBr специфически расщепляют

HN

~s

)=0 0-<NH

о

11

НСООН

0='"NH /

HN

>0

Рис. 4.10. Две соседние полилептидные цепи соединены ди­ сульфидной связью (J3TeHCHa). Расшепление этой связи пу­

тем ОКИС;Iения Нiiдмуравьиной кислотой (cleBa) или путем

восстанов",ения l3-меркаптоэтанолом (справа) приводит

К образованию двух пептидов. содержащих остатки цистсиновой кислоты или цистеина соответственно.

в большинстве случаев с количественным выходом.

Остатки метионина в полипептидах встречаются до­

статочно редко, поэтому в результате такого расще­

пления образуются пептидныe фрагменты желаемо­

го размера.

Б. Трипсин. Трипсин расщепляет связи на СООН­ стороне от остатков лизина и аргинина. Чтобы огра­

ничить число мест разрыва, остатки лизина предва­

рительно модифицируют цитраконовым ангидри­

дом (реакция носит обратимый характер); в резуль­

тате положительный заряд остатков лизина заменяе­ тся на отрицательный. Модификация остатков арги­ нина менее целесообразна, поскольку остатки лизи­

на встречаются относительно чаще. Однако она бы­

вает полезна для дальнейшего расщепления CNBr- фрагментов.

В. о-Иодозобензол. Этот реагент специфически и

с количественным выходом расщепляет сравнитель-

но выход не является количественным.

д. Протеаза из Staphylococcus aureus V8 расще­

пляет связи типа Glu-Х, преимущественно в тех слу­ чаях, когда Х- гидрофобный остаток. Связь GluLys не расщепляется. Эта реакция полезна также для последующего расщепления CNBr-фрагментов.

Е. МJlГКИЙ кислотный гидролиз. Расщеплению подвергаются редко встречающиеся связи Asp"'Pro.

Двух-трех наборов фрагментов, обычно получае­

мых ПРI! расщеплении исходного полипептида по

остаткам Met, Trp, Arg и по связям Asn-Gly, вместе

с субфрагментами, полученными при дополнитель­

ном расщеплении, обычно оказывается достаточно для определения полной первичной структуры поJiи­

пептида. Если не возникает каких-либо непредвиден­

ных трудностей в очистке фрагментов, то при дол­

жной тщательности для всей пр<щедуры необходимо

всего несколько микромолей полипептида. Фрагменты очищают. с помощью гель­

фильтрации в уксусной или муравьиной кислоте (рис. 4.7), с помощью жидкостной хроматографии

с обращенной фазой при высоком давлении (рис. 4.8) или ионообменной хроматографии на фосфоцеллю­

лозе или на сульфофенил-сефадексе.

Резrент ЭДмана и реакция Эдмана

При автоматическом секвенировании вместо ре­

агента Сенгера применяют фенилизотиоцианат (реа­

гент Эдмана); в результате ·реакции происходит от­

щепление N-концевого остатка в виде его фенилтио­ гидантоинового производного (реакция Эдмана;

рис. 4.11).

Все реакции протекают в пленке раствора, кото­

рая покрывает стенки вращающейся цилиндриче­

ской камеры. Это облегчает экстракцию и последую­ щее удаление растворителей. Несколько фирм выпу­

скают приборы, позволяющие проводить полно­

стью автоматизированное определение последовате­

льности полипептидов, содержащих до 30-40 остат­ ков (в некоторых случаях до 60 или даже до 80 остат­

ков) за один прогон. В прибор заложе~а программа

последовательного отщепления' по Эдману N-

концевых остатlCОВ полиnептида. После отщепiIения, выделения и идентификации исходной N-концевой

аминокислотьi (рис. 4.11) образуется эдмановское npоиэводное следующей аминокислоты и т. д. Иден­

тификацию фенилтиогидантоиновых производных производят с помощью жидкостной хроматографии

под давлением. На таком приборе можно опреде­ лить последовательность значительно более длин­

ных участков, чем при секвенировании вручную,

причем гораздо быстрее.