Marri_i_dr_-_Biokhimia_cheloveka_tom_1

го не известно о биохимической основе сложных про­

цессов нервиой деятельности, включая такие явления,

как сознание и память. Весьма ограниченны сведе­

ния о механизмах клеточной секреции. Несмотря на определенный прогресс, неизвестна молекулярная природа многих распространенных генетических бо­

лезней; впрочем, можно надеяться, что в ближайшие

Freifelder D. Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry and Molecular Biology, Freeman, 1982.

Fruton J. S. Molecules and Life: Historical Essays оп the Interplay of Chemistry and Biology, Wiley-Interscience, 1972.

Weinberg R. А. ТЬе molecu1es oflife, Sci. Аm. (Oct.), 1985,253,

48. (Интересны и все другие статьи этого ц:омера жур­

нала.)

ВВЕДЕНИЕ

в живых клетках синтезируется множество ма­

кромолекул (белков, нуклеиновых кислот, полисаха­ ридов), которые играют роль структурных компо­ нентов, биокатализаторов, гормонов, рецепторов

или хранилищ генетической информации. Эти ма­

кромолекулы представляют собой биополимеры, по­

некоторых аминокислот образуются соответствую­

щие амины, и некоторые из них [гистамин, у­

аминомасляная кислота (ГАМК)] выполняют ва­ жные биологические функции. Ряд заболеваний

связан с нарушениями транспорта аминокислот вну­

трь клеток. Эти заболевания часто сопровождаются

значительным повышением содержания одной или

нескольких аминокислот в моче; такое состояние на­

белков, а следовательно, и их биологические свой­

ства определяются в основном аминокислотным со­

ставом, порядком чередования аминокислот в поли­

пептидной цепи и как следствие ~x взаимным про-­

cTpaHcтвeвныM расположением.

Аминокислоты в клетках выполняют множество

важных функций; некоторые из биологически ва­

жных соединений, образующихся из аминокислот. приведены в табл. 3.4 и 3.5.

БИОМffiДИЦИНСКОЕЗНАЧЕНИЕ

Аминокислоты, являясь строительными блоками

пептидов и белков, выполняют и ряд других важных

функций. Некоторые из них, по-видимому, уча­

ствуют в передаче нервных импульсов; примерами

служат глицин и глутаминовая кислота. В пище дол­

жны содержаться незаменимые аминокислоты, по­

скольку организм человека не способен синтезиро­ вать их в количествах, достаточных для роста (в дет­

стве) и поддержания здоровья (во взрослом состоя­

нии).- В результате метаболизма аминокислот обра­ зуются многие соединения, имеющие биомедицин­

Аминокислоты содержат в качестве функциона­ льных групп аминогруппу и карбоксильную группу.

В а-аминокислотах обе они связаны с одним и тем

же (а) углеродным атомом (рис. 3.1).

В природе существует около 300 аминокислот, однако в белках обнаружены только 20 из них. В ре­

зультате полного гидролизаl белков высвобождае­

тся 20 L-а-аминокислот (табл. 3.2). Одни и те же 20

аминокислот присутствуют в белковых молекулах всех форм жизни- растений, животных и микроор­

ганизмов. Почему это так- мы поймем позже, ког­

да будем обсуждать универсальную природу генети­ ческого кода (гл. 30). Однако в ряде белков встре­ чаются производные некоторых аминокислот, обра­

зующиеся уже после включения обычных аминоки­

слот в молекулу белка (табл. 3.4).

За исключением глицина, у которого R - это

атом водорода, у всех аминокислот четыре группы,

связанные с а-углеродным атомом, различны. Бла­

годаря тетраэдрическому расположению четырех

1 Гидролиз- это разрыв ковалентной связи с присое­

аминокислота обладает оптической активностью

(способностью поворачивать плоскость поляриза­ ции плоскополяризованного света). Одни аминоки­ слоты, входящие в состав белков, являются (при рН

7,0) правовращающими, а другие-левовра­

щающими, однако все они имеют абсолютную кон­

фигурацию L-r:лицеральдегида и поэтому являются

L-а-аминокислотами.

ИОННЫЕ ФОРМЫ АМИНОКИСЛОТ

Аминокислоты несут по крайней мере две

слабоионизируемые кислые группы, -СООН и

-NH~. В растворе эти группы находятся в двух

формах, заряженной и незаряженной, между кото­

рыми поддерживается протонное равновесие:

R-COOH +:t R-COO- + Н+,

R-NH~~R-NH2+H+.

R - СООН и R - NH j здесь являются протониJЮ­

ванными партнерами, т.е. кислотами, а R-COO- и R-NН2-сопряженными основаниями (т.е. акцеп­

торами протонов) соответствующих кислот. И R -

СООН, и R-NН"э-ЭТО слабые кислоты, и все же R-COOH является в несколько тысяч раз более

сильной кислотой, чем При значениях рН, характерных для плазмы крови и межклеточной жидкости (7,4 и 7,1 соответственно), карбоксильные группы находятся исключительно в форме карбокси­ латных ионов, R-COO-. При этих значениях рН

большая часть аминогрупп находится преимуще­

ственно в ассоциированной (протонированной) фор­

ме, R - NH j. Преобладающая ионная форма ами­

нокислот, присутствующих в крови и в большинстве

тканей, представлена на рис. 3.2,А. Структура, изо­ браженная на рис. 3.2.Б, не может существовать ни при каких рН. При значениях рН, достаточно низких для протонирования карбоксильной группы, амино­ группа, намного более слабая кислота, также будет протонирована. Примерные значения РКа

а-карбоксильной и а-аминогрупп а-аминокислоты

равны 2 и 10 соответственно (табл. 3.1). Кислота при рН ниже своего РКа будет преимущественно прото­

нирована, Пр'ичем если рН будет сдвинуто на 2 еди­

ницы ниже рКа• она будет протонирована на 99%.

По мере увеличения рН карбоксильная группа те-

Относительную кислотность слабых кислот мо­

жно охарактерuзовать с помощью константы диссо­

циации кислоты Ка или соответствующего ей рК.­ отрицательного логарифма константы диссоциации:

рК. =-log К•.

В табл. 3.1 представлены кислотные группы и значения рК для функциональных групп 20 амино­ кислот, входящих в состав белков.

Полный (суммарный) заряд (алгебраическая сум­ ма всех положительных и отрицательных зарядов) аминокислоты зависит. от рН, Т.е. от концентрации ПJЮтонов в окружающем растворе. Заряд аминоки­

слоты или ее производного можно изменить, варьи­

руя рН; это облегчает физическое разделение амино­ кислот, пептидов и белков.

Значение рН, при котором суммарный зармд ами­

нокислоты равен нулю и поэтому она не перемещае­

тся в постоянном электрическом поле, называется ее

изоэлектрической точкой (pl). Для алифатических

аминокислот, таких как аланив, изоэлектрическая

форма имеет вид, представленный на рис. 3.3..

Изоэлектрическая точка находится посредине ме­ жду ближайшими значениями рК диссоциируюIЦИХ групп по разные стороны от pI. для аминокислоты,

имеющей только две диссоциирующие группы, ника­

кой неоднозначности при подсчете рI не возникает. Найдем, например, pI для аланина. Поскольку рК.

(R-COOH) = 2,35 и РК2 (R-NНj) = 9,69, изо­

электрическая точка (pI) аланина равна

Рассчитать рI для соединения, содержащего бо­

лее двух диссоциирующих групп, труднее, и в этом

Рис. 3.2. А. Правильная ионная структура аминокисдоты при значениях рН, близких к физиологическим. Б. Незаря­ женная форма, которая не может существовать ни при ка­ ких· значениях рН; впрочем. такого типа формулу удобно использоват-ь при обсуждении ХИМИИ ~инокислот.

а-Карбоксильная

ro-Карбоксильная (аспартат, глутамат)

Имидазольная (гистидин)

а~Аминогруппа

Е-Аминогруппа (лизин)

Фенольная ОН-группа (тирозин)

Гуанидиновая (аргинин)

Сульфгидрильная (uистеин)

А-СООН А-СОО- 2,1 ± о.р

А-СООН А-СОО- 4,0 ± 0,3

рис. 3.4? Чтобы однозначно ответить на этот вопрос,

нужно выписать все ионные структуры, возможные

для данного соединения, в том порядке, в котором

они образуlOТСЯ при переходе от сильнокислого к

щелочному раствору (как это бьuIO сделано ДJIЯ аспара­

гиновой кислоты на рис. 3.4). Затем следует найти область рН изоионной (цвиттерионной), т.е. ней­

тральной, формы (как на рис. 3.4,Ь). рl-это значе­

ние рН посредине между ближайшими значениями

рК по разные стороны от изоионной формы. Для

}:о-

11

о

РЕ. 3.3. Из-о:)леl:тричеаая форма аланина «щвиттерион»). Хотя цвиттерион содержит заряженные группы, его заряд

равен нулю. поэтому в постоянном элеl:тричесl:ОМ поле он

Этот подход в равной мере применим для других аминокислот с ДИССОЦИИРУlOщими группами в боко­ вой цепи, например для лизина или гистидина. Вы­

писав формулы для всех возможных заряженных

форм основных аминокислот, лизина и аргинина,

получаем

pI = рК? + рКэ•

2

Для лизина pI = 9,7, для аргинина pI = 10,8. Предла­

гаем вам найти pI гистидина.

Описанный выше подход- оценка заряда струк­

тур, рК которых находится по разные стороны от pI

цвиттериона,- пригоден не только для аминоки­

слот. Его можно применять для оценки заряда моле­ кулы с ЛlOбым числом ДИССОЦИИРУlOщих групп. Уме­

ние выполнять такие расчеты оказывается очень цен­

ным для работы в клинической лаборатории, пос:ко-.

льку позволяет предсказать подвижность соедине­

ствующий буфер для их разделения. Например, для

разделения двух соединений со значениями рI 6 и 8 ПРИFоден буфер с рН 7,0, поскольку при этом рН молекулы с рI = 6 будут нести суммарный отрицате­ льный заряд, а молекулы с pI = 8 - положительный.

СТРУКТУРА АМИНОКИСЛОТ

Аминокислоты, входящие в состав белков, мо­ жно разбить на две большие группы на основе того, какими явлЯются R-группы, связанные с атомом а­

углерода,- полярными или неполярными (табл.

3.2).

В табл. 3.3 приведены трехбуквенные и однобук­

венные обозначения аминокислот, которые широко используются в биохимии. Однобуквенные обозна­

чения применяются для записи наиболее длинных аминокислотных последовательностей (например, полных аминокислотных последовательностей бел­ ков).

Аминокислоты, находящиеся в свободном со­

стоянии или входящие в состав других соединений

(не белков), выполняют важную функцию во многих метаболических процессах (табл. 3.4 и 3.5). Напри­

мер, аминокислоты орнитин, цитруллин и аргинино-

Таб.1ица 3.2. КJIc.tеснфикаllИЯ L.,.u-аминокисnот, вхоЛ,ящих в состав белков. ОСНОВ<lнная на относите..1ЬНОЙ полярности их

R-rpynn

сукцинат (табл. 3.4) участвуют в метаболизме моче­ вины. В природных объек'тах обнаружено свыше 20 D-а.минокислот. К их числу относятся D-аланин и о­

глутамат, входящие в состав клеточных стенок неко­

торых бактерий; ряд D-аминокислот входят в состав антибиотиков.

РАСТВОРИМОСТЬ АМИНОКИСЛОТ

Аминокислоты содержат по нескольку заряжен­

ных групп, поэтому они легко сольватируются и хо­

рошо раст.воряются в полярных растворителях (во­

да, этанол) и не растворяются в растворителях непо­ лярных (бензол, гексан, эфир): Температура плавле­

ния аминокислот весьма высока (> 2000 С). Это то­ же обусловлено присутствием в них заряженных

групп. Для разрыва ионных связей, стабилизирую­ щих структуру кристалла, нужно сравнительно боль­

шое количество энергии.

ОБЩИЕ ХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

Карбоксильные и аминогруппы аминокислот

вступают во все реакции, характерные для этих

групп, т.е. в реакции образования солей, этерифика­

ции и ацилирования.

цBeтRыe реакции

Нввгидрив (рис. 3.5) осуществляет ОКислительное

декарбоксилирование а-аминокислот с образова­ нием СО2, NНэ и альдегида, содержащего на один

атом углерода меньше, чем исходная аминокислота.

Восстановленный нингидрин далее реагирует с выс-

О

11

~C)(OH

~c ОН

11

О

Рис. 3.5. Нингидрин.

НзС

'СН-СН2-СН-соо-

НзС/ .NH'"'

СН, З

СН

,2

СН-СН-СОО- "

СНЗ +NH:J

с боковыми цепями. содержащими атом серы Цистеин2 )

Метиоиин

Cys(C)

аминокислотами, но и с другими аминами; при этом

тоже появляется голубая окраска, но без выделения СО2• Таким образом, выделение СО2 является инди­

катором участия в реакции а-аминокислоты. NНэ

и пептиды тоже вступают в реакцию, но менее ак­

тивно, чем а-аминокислоты. Продукт реакции ме­

жду пролином (или 4-гидроксипролином) И нингид­

рином имеет желтую окраску.

Флуорескамин (рис. 3.6) является еще более чув­

ствительным реагентом, позволяющим обнаружи­

вать аминокислоты в количестве порядка нано­

~H20

+НЗN~

'уУО-

О

Образование пептидных связей

Наиболее важной реакцией, в которой участвуют аминокислоты, является образование пептидныx связей. При этом высвобождается одна молекула во­

ды (рис. 3.7). Однако реакция осуществляется не так,

как она представлена на рисунке, поскольку равнове-

Рис. 3.7. Соединение аминокислот пептидной связью (зате­

ненная область).

сие сильно сдвинуто в сторону гидролиза пептидной

связи. Для· образования пептидной связи между

двумя аминокислотами карбоксильная группа дол­ жна быть предварительно активирована. Химиче­

ский синтез осуществляется путем предварительного

образования хлорангидрида. Биологическая актива­ ция включает взаимодействие с АТР.

СВОЙСТВА ИНДИВИДУАЛЪНЫХ АМИНО­

КИСЛОТ

гЛИЦИII, наименьшая из аминокислот, может ло­ кализоваться в таких областях трехмерной структу­ ры белковой молекулы, которые недоступиы дрyrим

Алифатические R-грУППbI аланина, валина, лей­ цина и изолейцина и ароматические R-группы фени­

лаланина, тирозина и триптофана гидрофобны; это

свойство приводит К одному очень важному послед­

ствию-образованию упорядоченного поверхност­

ного слоя молекул воды в области поверхности мо­

лекулы белка, где экспонированы неполярные R- группы. Заряженные R-группы основных и кислых

аминокислот играют важную роль в С"iабилизации специфической конформации белка путем образова­ ния солевых связей. Кроме того, аминокислоты с по­

ложительно и отрицательно заряженными R-

группами, а также гистидин могут участвовать

вформировании систем «переноса заряда», которые

входе ферментативного катализа обеспечивают

перемещение заряда на значительные расстояния.

Наконец, уникальная и очень важная роль в фермен­

тативном катализе принадлежит гистидину- рК ИМИДазольной группы таково, что эта аминокислота

при рН = 7 может попеременно выступать в роли ос­

новного или кислотного катализатора.

Первичная спиртовая группа серина и первичная тиоспиртовая (-SH) группа цистеина являются

в определенных условиях хорошими нуклеофилами

и участвуют в ферментативном катализе. Хотя вто­

ричная спиртовая группа треонина тоже является ну­

клеофилом, данные о ее возможной катали:rической

роли отсутствуют. Помимо каталитической функ­

ции -ОН-группа серина участвует в регуляции ак­

тивности некоторых ключевых ферментов метабо­ лизма, активность которых зависит от фосфорили­

рования определенных остатков серина.

Аминокислоты не поглощают свет в видимой

области (иными словами, они не окрашены). За ис­

ключением ароматических аминокислот триптофа­

на, тирозина, фенилаланина и гистидина, они не по­

глощают и в ультрафиолетовой области при длинах волн выше 240 нм. Как видно из рис. 3.8, поглощение

ТРИПТОфёlН

Тироэин

ДI1ина волн.,•• нм

Рис. 3.8. Спектры поглошения ТРИПТОфiiН", тирозина и фе­

нилаланина в УФ-области.

белков в этой области обусловлено в основном трип­ тофаном.

МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ

Хроматография

При всех хроматографических методах разделе­

ния молекулы распределяются между стационарной

и подвижной фазами (Тclбл. 3.6). Разделение зависит от относительной способности содержащихся в смеси

молекул к более прочной ассоциации с одной или дру­

гой фазой.

Здесь мы рассмотрим в основном методы разде­

ления аминокислот, однако применение этих мето­

дов ни в коей мере не ограничивается данными моле­

кулами.

Хроматография на бумаге

Сейчас этот метод в значительной мере вытеснен

более совершенными методами, однако он все же

применяется для разделения аминокислот. Образцы наносят на бумагу в заранее отмеченную точку, от­

ступив примерно 5 см от верхнего края полоски

фильтровальной бумаги. Затем полоску подвеши-·

вают в закрытом сосуде, на дно которого налита

смесь растворителей (рис. 3.9).

Для разделения аминокислот используют поляр­ ные растворители в виде бинарных, тройных и более

сложных смесей воды, спиртов, кислот и оснований.

Более полярные коМпоненты растворителя ассоции­ руются с целлюлозой и образуют стационарную фа-

ТаБДИl\а 3.6. Физическое состояние фаз в ХРО\ofатографиче­ ских системах. используемых в биохимии

тонком слое порошка

целлюлозы, на колонке

с инертным носителем,

покрытым тонким сло­

ем жидкости; гель­

фильтрация

Ионообменная хроматоТвердая графия: адсорбция на

тонких слоях или ча­

стицах, заполняющих

колонку

Распределительная xp~Ma­ Жидкая Газообразная

ТOI"рафия (между тон­

ким слоем жидкости на

носителе и подвижным

газом)