Marri_i_dr_-_Biokhimia_cheloveka_tom_1

Рис. 10.2. Количество фер~снта опрел.епяется би.'шнсом

ПРОЦСССО8 его синтеза и распал.а.

личество фермента уменьшается в результате либо

уменьшения kсинт, либо увеличения kрuсп' либо и тем

и другим путем. В клетках человека может происхо­

дить изменение и kсинт• и kpuсп. У всех живых организ­ мов синтез ферментов (и всех других белков) из ами­ нокислот и распад фермента (белка) на аминокисло­ ты представляют собой разные процессы, которые

катализируются совершенно разными наборами

ферментов. В этих условиях легко осуществляется независимая регуляция скорости синтеза фермента

и скорости его распада.

Синтез ферментов детерминируется

информацией, содержащейся в ДИК

Первичная структура фермента, как и любого

другого белка, определяется той информацией, кото­

рая записана в информационной (матричной) РНК

(мРИК) и считывается с помощью трехбуквенного (триплетного) кода. Иуклеотидная последователь­

ность мРИК в свою очередь определяется компле­ ментарной последовательностью оснований ДИК­ матрицы. т. е. соответствующего гена (см. гл. 38

и40).

Врезультате мутаций нуклеотидная последовате­ лыюсть ДИК может измениться. и будут синтезиро­ ваться белки с измененной первичной структурой. Если новая аминокислота сильно отличается по своим свойствам от исходной, изменения могут охватить высокие уровни структурной организации

иможет произойти частичная или полная утрата ка­

талитической активности (впрочем. в редких случаях

наблюдается. напротив, ее повышение). Мутации

в различных генетических локусах могут приводить

к нарушению синтеза самых разных ферментов и тем

самым к развитию многих генетических заболева­

ний.

ры одновременно служат субстратами ферментов,

которые они индуцируют, однако в роли индукторов

могут выступать и соединения, структурно сходные

ссубстратом, но сами не являющиеся субстратами.

Инаоборот, соединение может быть субстратом, но

не являться индуктором. Иередко какое-либо соеди­

нение индуцирует сразу несколько ферментов данно­

го катаболического пути. В этих случаях говорят, что структурные гены, кодирующие группу катабо­

лических ферментов, составляют оперон. и все фер­

менты, кодируемые генами оперона, индуцируются

единственным индуктором (координированная ин­

дукция). Способность регулировать синтез фермен­

тов с помощью того или иного питательного ве­

щества позволяет бактерии использовать это пита­ тельное вещество с максимальным для себя преи­

муществом; в то же время «ненужные» ферменты

бактерия не синтезирует.

Ферменты, концентрация которых в клетке не за­

висит от добавления индукторов, называются кон­ СТlIТУТИВНЫМИ. Данный фермент может быть консти­

тутивным для одного штамма, индуцируемым для

другого и вообще отсутствовать в третьем. Обычно клетки содержат небольшое, но измеримое количе­ ство соответствующего фермента даже в отсутствие индуктора. Это- базовый уровень. Величина откли­

ка данного организма на введение индуктора опре­

деляется генетически (см. гл. 41). При индукции раз­

личных штаммов может наблюдаться повышение

содержания фермента, варьирующее O'F'двукратного

до тысячекратного. Таким образом, содержащаяся

в клетке наследственная генетическая информация

определяет и характер, и величину реакции на введе­

ние индуктора. Следовательно. понятия «конститу­

тивный» И «индуцируемый» относительны: они ха­ рактеризуют лишь крайние точки всего спектра воз­ можных реакций.

Индукция ферментов наблюдается и у 'Эукариот.

Примерами индуцируемых ферментов у млекопи­

тающих являются триптофанпирролаза, треонинде­

гидраза, тирозин-а-оксоглутарат- грансаминаза,

Индукция ферментов

Клетки могут синтезировать специфические фер­ менты в ответ на присутствие специфических низко­

молекулярных индукторов. Индукцию ферментов

можно проиллюстрировать на следующем примере.

Клетки Escllerichia co/i, выращенные на глюкозе, не способны сбраживать лактозу из-за отсутствия фер­

инвертаза. ферменты цикла мочевины, ИМG-

CoA-редуктаза и цитохром Р-450.

Репрессия и дерепрессия ферментов

Бактерии, способные синтезировать определен­ ный метаболит, при наличии этого метаболита

в среде могут приостановить его сингез в результате

Фермеllты: регуляция

пример пурин или аминокислота. действуя как коре­

прессор. блокирует синтез ферментов, участвующих в биосинтезе самого корепрессора. Например, до­ бавление гистидина в среду. на которой растет бак­ терия Sa/mone/la (урЫmurium, подавляет (репресси­ рует) синтез всех ферментов биосинтеза гистидина;

добавление в среду лейцина репрессирует синтез пер­

вых трех ферментов, которые участвуют исключите­

льно в биосинтезе леЙцина. В обоих случаях гены

ферментов. ответственных за биосинтез данного ме­ таболита. образуют оперон: добавление в среду ко­ нечного продукта биосинтеза, гистидина или лейци­ на, вызывает координированную репрессию. Коорди­ нированная репрессия наблюдается не для всех путей

биосинтеза. После удаления из среды корепрессора

или же при истощении его запасов биосинтез соот­ ветствующих ферментов возобновляется. Это явле­ ние называют дерепрессиеЙ. Дерепрессия может быть

координированной инекоординированной. Приведенные выше примеры иллюстрируют ре­

прессию конечным продуктом по принципу обратной связи, характерную для процессов биосинтеза в бак­ териях. Сходное явление- катаболитная репрес­

дспартат'

l дспартокиназа

Enz, ~

сия - состоит в том, что одно из промежуточных со­

единений в цепочке катаболических ферментативных

реакций репрессирует синтез катаболических фер­ ментов. Оно было впервые обнаружено при изучении культуры Е. сои, растущей на среде, которая содер­

жит в качестве источника углерода не глюкозу,

а другое соединение (Х). Добавление глюкозы ре­

прессировало синтез ферментов. участвующих в ка­

таболизме Х. Это явление вначале называли «эффект глюкозы», но потом обнаружилось, что сходные эффекты могут вызывать и другие окисляе­ мые питательные вещества; поэтому был предложен

термин «катаболитная репрессия». Катаболитная

репрессия осуществляется при участии сАМР. Моле­

кулярные механизмы индукции, репрессии и дере­

прессии осуждаются в гл. 41.

В разветвленных процессах биосинтеза, напри­

мер при биосинтезе аминокислот с разветвленными

боковыми цепями или аминокислот семейства

аспартата, ферменты начальных стадий участвуют

в биосинтезе нескольких аминокислот (рис. 10.3).

Если в среду, на которой растут бактерии, добавить

лизин. репрессируется синтез ферментов, у~аствую­ щих исключительно в биосинтезе лизина (EnzL). До­

бавление в среду треонина вызывает репрессию фер­

ментов, участвуlpЩИХ только в биосинтезе треонина

(EnzT ). Это - примеры простой репрессии конечным продуктом. В то же время ферменты Enz. и Enz2 (рис. 10.3) участвуют одновременно в биосинтезе

илизина, и треонина. Если бы репрессию их синтеза

вызывал каждый из конечных продуктов по отдель­

ности, то наблюдался бы недостаток другой амино­ кислоты. Если же в среду добавить одиовременно

илизин, и треонин, то ферменты Enzl и Enz2

ИзолейLLИН

Рис. 10.3. Синтез аминокислот семейства аспартата. Под

ЕПZL и ЕпZт подразумеваются группы ферментов, уча­

ствующих в биосинтезе лизина и треонина соответственно.

Число стрелок соответствует числу стадий.

окажутся излишними; их репрессия была бы выгодна

бактерии. поскольку позволила бы более эффектив­

но использовать имеющиеся питательные вещества.

В присутствии всех конечных продуктов, обра­

зующИхся на различных ответвлениях пути биосин­

теза, может наблюдаться мультивалеНПlая репрес­ сия. Это происходит только тогда, когда все конеч­

ные продукты, синтезируемые данным набором фер­ ментов, присутствуют в избытке. Следовательно,

для полной репрессии аспартокиназы (Enz.) необхо­

димо присутствие не только лизина и треонина, но

также еще и метионина. и изолеЙцина.

Обновление ферментов

в быстро растущих бактериях общая скорость

распада белков составляет около 20/0 в час. Иное по­ ложение складывается, когда бактерии находятся

вусловиях голодания или их переносят на свежую среду, бедную углеродом. В этих условиях распад

бактериальных белков идет со скоростью 7-1Q%

вчас.

Сочетание процессов синтеза и распада фермен­ тов называют обновлением ферментов. Обновление происходит и у бактерий, и у млекопитающих, одна­ ко значение распада ферментов как средства регуля­ ции их количества у бактерий недооценивалось.

в клетках млекопитающих обновление белков было обнаружено гораздо раньше, чем у бактерий. Указа­

ния на этот процесс у человека были получены более

CTd лет назад на основании наблюдений за людьми, получавшими специальную диету. Однако лишь по­

сле классических работ Шёнхеймера, начатых неза­ долго до второй мировой войны, было твердо уста­ новлено, что обновление клеточных белков происхо­

дит на протяжении всей жизни. Измеряя скорость

включения в данный белок 1 SN-меченных аминоки­

слот и скорость утраты метки белком, Шёнхеймер

пришел к выводу, что белки в организме человека

находятся в состоянии «динамического равновесия»;

это представление позднее было распространено на

другие компоненты организма, включая липиды

и нуклеиновые кислоты.

Регуляция синтеза и распада ферментов

Основные этапы синтеза белков достаточно хо­

рошо изучены, чего нельзя сказать о процессах ра­

спада ферментов. Распад ферментов происходит

в результате их гидролиза протеолитическими фер­ ментами. но о механизме регуляции этой протеоли­ тической активности мало что известно. Установле­ но только, что процессы регуляции могут быть со­ пряжены с расходованием АТР. Чувствительность

фермента к протеолизу зависит от его конформации. Присутствие или отсутствие субстратов, кофермен­ тов, ионов металлов- все это способно влиять на конформацию белка и его чувствительность к про­

теолизу. Поэтому скорость распада специфических ферментов может зависеть от концентрации в клет­

ке субстратов, 1C0ферментов и, возможно, ио­ нов. Эти представления можно хорошо ПРОИЛ.;IЮ­

стрировать на примере аргиназы и триптофанокси­ геназы (триптофанпирролазы). Регуляция содержа­

ния аргиназы в печени может осуществляться путем

изменения либо kсинr, либо kрасп• Переход на обога­

щенную белковую диету приводит к возрастанию со­ держания аргиназы из-за повышения скорости ее

синтеза. Содержание фермента в печени возрастает

также у голодающих животных. Но это обусловлено

снижением скорости распада аргиназы, поскольку

значение kсинт ост~ется постоянным. Теперь о ситуа­ ции, которая наблюдается со вторым ферментом:

инъекция млекопитающим глюкокортикоидов, как

нает индукцию субстратом, наблюдающуюся у бак­ терий. Для триптофанпирролазы ситуация иная: в бактериальных клетках Trp может действовать как индуктор (увеличивая kсиllт), но в тканях млекопи­

тающих он действует только на процесс распада

фермента (уменьшает kра.:п).

Содержание ферментов в тканях млекопитающих

может изменяться в результате действия различных физиологических и гормональных факторов, а также

под влиянием диеты. Известно много примеров та­

кого рода для разных тканей и различных метаболи­

ческих путей (табл. 10.1), однако наши знания о мо­ лекулярном механизме процессов носят фрагмен­

тарный характер.

Глюкокортикоиды повышают концентрацию ти­

розин-трансаминазы, увеличивая kсинт• На этом при­

мере была впервые четко показана гормональная ре­ гуляция синтеза фермента в тканях млекопитающих. Инсулин и глюкагон, несмотря на взаимный антаго­

низм их физиологического действия, оба независимо

повышают kсиltт в 4-5 раз. Действие глюкагона. ве­

роятно, опосредуется сАМР, который оказывает

аналогичное гормону действие в органной культуре

печени крысы.

Превращение проферментов в активные ферменты

Ферментативная активность может регулирова­

ться путем превращения неактивного профермента

вкаталитически активную форму. Чтобы перейти

втакую форму, профермент должен подвергнуться

ограниченному протеолизу, сопровождающемуся

конформационными изменениями; при этом проис­

ходит либо демаскирование каталитического цен­ тра, либо его формирование (см. гл. 8). Синтез

в форме каталитически неактивных проферментов является характерным свойством пищеваРlпельных

ферментов, а также ферментов системы свертывания

крови и системы фибринолиза (см. гл. 55).

РЕГУЛЯЦИЯ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

и инъекция триптофана, повышает содержание трип­ тофаноксигеназы. Гормон вызывает повышение ско­

рости синтеза фермента kсиит, тогда как Тгр не ока­

зывает влияния на kо:иН1• а понижает kрасп' повышая устойчивость оксигеназы к протеолизу. Сравним оба

этих примера с индукцией ферментов у бактерий.

В случае аргиназы повышенное потребл~ние азота

при нахождении на обогащенной белковой диете мо­ жет увеличить содержание аргиназы (см. гл. 30). По­

вышение скорости синтеза аргиназы внешне напоми-

Определения

Если в результате физиологических процессов из­

меняется активность фермента, то мы часто не мо­

жем сказать, чем это обусловлено - изменением ко­

личества фермента или эффективности его функцио­

нирования. Мы будем называть все изменения актив­ ности фермента, происходящие при постоянном коли­ честве присутствующего фермента, изменением его

каталитической эффективности.

Углеводный обмен

Глюкозо-6-фосфатдегидроге- 15

наза

дов

+10

+30

-10 +30

lCонцентрации реактантов

Изучение кинетических и регуляторных свойств

ферментов позволяет лучше понять характер физио­

логических процессов, протекающих в неповрежден­

ных клетках, в тканях и целом организме. Однако большая часть информации получена при изучении ферментов in vitro, в условиях, существенно отли­

чающихся от тех. которые имеют место в живых

клетках. Поэтому распространение полученных дан­

ных на условия in vivo требует осторожности. На­

пример, концентрации субстратов in vitro могут зна­

чительно отличаться от тех, которые имеются in vi-

vo.

Компартментация ферментов

Роль компартментации (пространственного раз­ деления) метаболических процессов в клетках эука­

риот, в том числе в клетках млекопитающих, трудно

переоценить. Локализация специфических метаболи­

ческих процессов в цитозоле или в клеточных орга­

неллах облегчает независимую регуляцию этих про­

цессов. Развитая компартментация метаболических процессов особенно характерна для высших форм

наиболее тонкую регуляцию метаболизма. Одновре­

менно при этом возникает новая проблема­

прохождение метаболитов через разделяющие ба­

рьеры. Эта проблема решается с помощью «челноч­ ных механизмов», переводящих метаболит в форму,

\

которая способна проходить через барьер. Затем по

другую сторону барьера происходит обратное пре­

вращение метаболита в первоначальную форму.

В связи с наличием барьеров возникает потребность

вфункционировании, например, цитозольной и ми­

тохондриальной форм некоторых ферментов. По­

скольку эти формы фермента физически разделены.

их независимая регуляция облегчается. Роль челноч­

ных механизмов в поддержании равновесия между

метаболическими пулами восстановительных экви­

валентов промежуточных продуктов цикла лимон­

ной кислоты и ряда других интермедиатов обсу­

ждается в гл. 17.

Макромолекулярные комплексы

Объединение набора ферментов. катализирую­ щих многоступенчатую последовательность метабо­

лических реакций, в макромолекулярный комплекс позволяет координировать работу ферментов и ка­

Эффективные концентрации субстратов, коферментов и катионов

Средние внутриклеточные концентрации субстра­

та, кофермента или ионов металлов мало что могут

сказать нам о поведении фермента in vivo. Необхо­

димо иметь информапию о концентрациях соответ­

ствующих метаболитов в Ilепосредственном окруже­

нин рассматриваемого фермента. Однако даже изме­ рение концентрации метаболита в отдельных ком­

партментах клетки не позволяет учесть локальные

формацию. Ионы Mg2+ или Mn2+ превращают синта­ зу в активную, «напряженную» форму. Кроме того,

аденилирование синтазы меняет ее специфичность­

фермент отдает предпочтение уже не Mg2+, а Mn2 +. И наконец, активность аденилированного фермента становится чувствительной к отношению ATPjMg2 +, тогда как неаденилированная форма этой особенно­ стью не обладает.

АЛЛОСТЕРИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ

перепады его концентрации внутри компартмента,

обусловленные, например, приближением к месту

поступления или синтеза метаболита. Наконец, да­

леко не всегда обращают достаточное внимание на различие между общей концентрацией метаболита и концентрацией свободного метаболита. Напри­ мер. общая концентрация 2,З-бисфосфоглицерата

в эритроцитах очень велика, тогда как концентрация

свободного бисфосфоглицерата в этих клетках срав­ нима с его концентрацией в других тканях. Эритро­ циты содержат приблизительно 5 ммолей гемогло­ бина. которые связывают 1 моль бисфосфоглиuера­ та на моль дезоксигенированного тетрамера. Поэто­ му при обшем содержании бисфосфоглицерата 4 ммоля концентрация свободного бисфосфоглицера­

та в эритроцитах венозной крови оказывается значи­

тельно меньше. Подобные же явления наблюдаются

и в случае других метаболитов в присутствии эффек­

тивно связывающих их белков, значительно пони­

жающих концентрацию С1l0бодных метаболитов.

Кинетический анализ Михаэлиса - Ментен осно­

ван на предположении, что общая концентрация суб­ страта равна концентрации свободного субстрата. Как мы видим, in vivo это предположение может не

выполняться, поскольку в этом случае концентрация

свободного субстрата часто бывает примерно того

же порядка, что и концентрация фермента.

Ионы металлов, играющие каталитическую

и структурную роль в действии многих ферментов (в

их число попадает свыше четверти всех известных

ферментов, см. гл. 9), могут осуществлять и регуля­

торные функции, особенно в тех случаях, когда суб­

Принципы

Ка галитическая активность некоторых регуля­

торных ферментов может модулироваться низкомо­

лекулярными аллостерическими эффекторами, обычно имеющими либо незначительное структур­ ное сходство с субстратами или с коферментами ре­ гулируемого ими фермента, либо не имеющими его

вообще. Ингибирование фермента. Катализирующе­

го одну из реакций в цепи, конечным продуктом этой

цепи называют ингибированием по принципу обратной связи. В цепи реакций биосинтеза D из А, катализи­

руемой ферментами Enz., ... Еnzз:

при высоких конuентрациях D обычно наблюдается ингибирование превращения А в В. Это не простое «обращение» реакции, связанное с накоплением про­

межуточных продуктов, а следствие того, что про­

дукт D способен связываться с ф~рментом Enz•. вы­ ступая в качестве его ингибитора. Таким образом. D

действует как отрицательный аллостерический эффек­

тор фермента, или ингибитор. действующий по прнн­ ципу обратной СВRЗИ. Следовательно. ингибирова­ ние Enz. под действием D регулирует синтез О. Обычно D связывается с ингибируемым ферментом

в аллостерическом центре, удаленном от каталитиче­

ского центра.

В кинетическом плане ингибирование по принци­

пу обраrnой связи может бъпь конкурентным, не­

конкурентным, частично конкурентным и смешан­

продукта - His, Trp или стр.

Цепь реакций биосинтеза часто бывает разветв­

денной-ее первые реакции дают начало синтезу

сразу двух или большего числа метаболитов. На рис.

10.4 указаны вероятные участки в разветвленной це­ пи биосинтеза, по которым осуществляется простое ингибирование по принципу обратной связи (инги­ биторами могут служить аминокислоты, пурины

или пиримидины). S., S2 И SЗ являются предшествен­

никами всех четырех конечных продуктов (А. В, С и О), S4-предшественником В и С, а ss-

предшественником только О. Последовательности

гибировании ингибllрующее действие двух и более

конечных продуктов на один и тот же регулируемый

фермент строго аддитивно.

В случае согласованного или мультивалентного ингибирования полное ингибирование наблюдается только тогда, когда в избытке одновременно присут­

ствуют два или более конечных продукта.

При кооперативном ингибировании ингибирующее

действие на регуляторный фермент окаЗЬiвает избы­ ток каждого из конечных продуктов, но ингибирую­ щее действие сразу двух и более конечных продуктов

намного превосходит аддитив"ый эффект, характер­

являются линейными и могут подвергаться ингиби­

рованию конечными продуктами по принципу

обратной связи.

Более тонкая регуляция осуществляется с помо­ щью множественных петель обратной связи (рис.

10.5). Например, если В присутствует в избытке. то снижается потребность в S2' Следовательно. способ­

ность В ингибировать процесс, в котором сам этот

продукт образуется, представляется биологически

целесообразной. Однако, если избыток В ингиб~­

рует не только реакции. которые связаны исключи­

Te:IbHO с синтезом В, но и те реакции, которые одно­

временно ведут к синтезу А, С и О, то он будет пре­ пятствовать синтезу всех четырех продуктов. Это, конечно, нецелесообразно. Впрочем, сформирова­

лись механизмы, позволяющие преодолеть эту труд­

ность.

Существует несколько вариантов ингибирования по принципу обраТНQЙ связи. При кумулятивном ин-

I Имеется в виду реакция. равновесие которой (в тер­

модинамическом смысле) сильно смещено в одну сторону. т. е. реакция, характеризующаяся большим по величине от­

рицательным значением!! G.

теристики. В Е. coli синтезируются три аспартокина­

зы. Одна из них (AKL) специфически и полностью

ингибируется лизином, другая (AKt)-треонином, а третья (AKh)-гомосерином, предшественником Met, Thr и Пе (рис. 10.6). Избыток Lys Иllгибирует

AKL , что приводит К снижению синтеза р­

аспартилфосфата. Но одного только этого еще недо-

Рис. 10.5. Множественное ингибирование по принципу

обратной связи на различных участках разветвленного био­ синтетического пути. Помимо простых петель обратной связи (кривые штриховые стрелки) указаны петли (кривые сплошные стрелки), регулирующие активность ферментов,

общих для процессов биосинтеза нескольких конечных про-

дуктов.

Метионин

Изолемцин

Рис. 10.6. Регуляция активности аспартокиназы (ДК) в клетках E-coli. Изоформы фермента подвергаются изби­

рательному ингибированию отдельными конечны~и про­

дуктами - лизином (ДК,). треонином (АКт) и гомосерином (дкн),

статочно, чтобы направить метаболиты на синтез

гомосерина и последующих продуктов. Переключе­

ние на этот канал биосинтеза происходит с помо­

щью ингибирования по принципу обратной связи.

ферментов. участвующих в следующих звеньях пути

биосинтеза. Лизин ингибирует также первый фер­ мент в последовательности реющий, ведущих от р­

аспартилфосфата к лизину. Это облегчает неограни­

ченный синтез гомосерина. а, следовательно. также

треонина и изолеЙцина. Следующее место регуляuии

находится на участке разветвления, из которогоод­

на ветвь ведет к метионину, а другая - к треонину

иизолеЙцину.

Отом, что рассмотренные варианты регуляции метаболизма реально функционируют. свидетель­ ствуют данные о характере ингибирования конечны­

ми продуктами пути биосинтеза. начинающегося

с аспартата. у различных бактерий (табл. 10.2). Наиболее полно изученный аллостерический фер­

мент. аспартат-транскарбамоилаза, катализирует первую реакцию. 'уникальную для биосинтеза пири­

мидинов (рис. 10.7). Аспартат-транскарбамоилаза

(АТКаза) ингибируется по принципу обратной связи цитидинтрифосфатом (СТР). После обработки рту­

тьсодсржащими реагентами АТКаза теряет чувстви­ тельность к СТР, но сохраняет полную активность

при синтезе карбамоиласпартата. Это означцет. что СТР связывается не в тех участках. где находятся

центры связывания субстратов, а в специальном ал­ лостерическом центре. АТКаза состоит из двух ката­

литических и трех или четырех регуляторных прото­

меров. Каждый каталитический протомср содержит

четыре аспартатсвязывающих центра, а каждый ре­

гуляторный-по меньшей мере два СТР­

связывающих (регуляторных) иентра. Каждый тип

протомеров находится под независимым генетиче­

ским контролем. Это было показано путем отбора

мутантов, лишенных нормального контроля со сто­

роны СТР; из этих мутантов были получены ревер­ танты, обладающие практически нормальными ре­

гуляторными свойствами.

Данные о существовании аллостерических центров у регуляторных ферментов

Примерно в 1963 г. Моно обратил внимание на

отсутствие структурного сходства между ингибито­ ром, действующим на фермент по принципу обрат­

ной связи, и субстратом этого фермента. Отсутствие изостеричности с субстратом позволяет говорить об

аллостеричности соответствующих эффекторов. Ис-

О

11

-о-с

нэ+

Карбамоил· + L-Аспартат

фосфат

Р; Аспартат-

транскарбамоилаэа

о

11

-О-с

Карбамоиласпартат

Рис. 10.7. Реакция, катализируемая аспартат-транс­

карбамоилазой (дТКазоЙ).

ходя из этого, Моно предположил, что ферменты, регулируемые такими аллостерическими эффектора­

ми (в частности. ингибиторами по ПрИНl.Щпу обрат­

ной связи), связывают эффектор в аллостерическом

центре, физически не совпадающем с каталитическим

центром. Таким образом, аллостерические фермен­

ты - это ферменты, активность каталитического центра которых изменяется под действием аллосте­ рических эффекторов. связывающихся в аллостери­ ческом центре. Данные о наличии у регуляторных

ферментов физически обособленных аллостериче­

ских центров сводятся к следующему.

1. Регуляторные ферменты после модификаuии химическими или физическими методами часто ста­ новятся нечувствительны к аллостерическим эффек­ торам, сохраняя каталитическую активность. Пока­

зана избирательная денатураuия аллостерических

центров при действии на ферменты ртутьсодержа­

щих реагентов. мочевины. рентгеновских лучей. про­

теолитических ферментов. растворов с экстремаль­

ными значениями ионной силы или рН. при длитель­

ном хранении при 0--5'-' С, замораживании или на­

гревании.

2. Аллостерические эффекторы часто защищают

каталитический иентр от денатурации в условиях.

когда субстрат такого защитного действия не оказы­

вает. Трудно представить себе ситуацию. при кото­ рой эффектор. связываясь в каталитическом центре.

защищает фермент, а субстрат такой способностью

не обладает. Поэтому естественнее предположить.

что эффектор связывается в другом, аллостериче­

ском, центре фермента.

З. Обнаружены мутантные клетки бактерий и млекопитающих, в которых регуляторные фермен­

ты имели существенно иные регуляторные свойства. чем ферменты из клеток дикого типа. но обладали

в точности такими же каталитическими свойствами. Отсюда следует. что структура аллостерического

и каталитического центров детерминируется разны­

ми участками гена.

4. ПQказано. что связывание субстратов и алло­ стерических эффекторов с регуляторным ферментом

происходит независимо.

5. В некоторых ферментах (например. в АТКазе)

аллостерический и каталитический центры локали­

зованы в разных протомерах.

lCииетика аллостерического иигибироваиия

На рис. 10.8 представлены зависимости скорости

реакции. катализируемой типичным аллостериче­

ским ферментом. от конuентрации субстрата в при­ сутствии и в отсутствие аллостерического ингибито­ ра. В отсутствие ингибитора наблюдается гипербо­

лическая кривая насыщения. В его присутствии кри­

вая приобретает сигмоидный вид при высоких кон­

центрациях субстрата скорость реакции может до-

стигать значений: близких к тем. которые наблю­

даются в отсутствие ингибитора. Обратите внима­

ние на аналогию. которая прослеживается в этом

случае с кривыми насыщения кислородом миоглоби­

на и гемоглобина (гл. 6).

По данным кинетического анализа. ингибирова­

ние по принципу обратной связи может быть конку­

рентным. неконкурентным. частично конкурентным

или может носить иной характер. Если при высоких

концентрациях S активность фермента примерно

одинакова в присутствии и в отсутствие аллостери­

ческого ингибитора. то кинетика внешне сходна с ки­

нетикой конкурентного ингибирования. Однако. по­ скольку кривая насыщения субстратом все-таки но­ сит сигмоидныЙ. а не гиперболический характер, ме­

тод построения графиков в обратных координатах для аллостерических ингибиторов непригоден; он

предложен для конкурентного ингибирования в ка­

талитическом центре. Поскольку аллостерические ингибиторы связываются с ферментом R другом (ал­ лостерическом) центре, исходная кинетическая мо­

дель утрачивает силу.

Сигмоидный характер зависимости V от [S] в присутствии аллостерического ингибитора обу­ словлен эффектом кооперативности. При низких кон­ центрациях S активность в присутствии ингибитора существенно ниже, чем в его отсутствие. Однако при увеличении [S] ингибирующее действие становится менее выраженным. Такая же кинетика наблюдае­

тся. когда имеются два или больше взаимодей­ ствующих субстратсвязывающих центра: присут­ ствие молекулы субстрата в одном каталитическом

центре облегчает связывание молекулы BToporo суб­

страта в другом центре. Кооперативность связыва-

00

______________________________

Рис. 10.8. Сигмоидная кинетическая кривая насыщения суб­ стратом в присутствии аллостерическоrо ингибитора.

ния субстратов была описана в гл. 6 на примере ге­

моглобина. Сигмоидный характер кривой насыще­

ния гемоглобина кислородом обусловлен коопера­

тивными взаимодействиями четырех связывающих

02 центров, локализованных в разных протомерах.

Модели аллостерии

JO

ствие как раз тогда, когда в нем имеется наибольшая

необходимость: при низких внутриклеточных кон­ центрациях субстрата. По мере повышения концен­ трации субстрата необходимость в строгой регуля­ ции уменьшается, поэтому степень ингибирования

понижается, что приводит к образованию большего

количества продукта. По аналогии с гемоглобином

сигмоидная кривая насыщения субстратом в присут­

Попытки описать кинетику аллостерического ин­

гибирования как «конкурентную» или «неконкурент­

ную» по отношению к субстрату основаны на чисто механической аналогии, которая может ввести в за­

блуждение. Поэтому мы будем говорить о двух классах регуляторных ферментов - ферментах К­ ряда и ферментах V-ряда. Насыщение субстратом

аллостерических ферментов К-ряда выглядит как

конкурентный процесс в том смысле, что КМ

увеличивается (уменьшается сродство к субстрату), и при этом значение VтИХ никак не изменяется. В слу­ чае аллостерических ферментов V-ряда уменьшается Vта" (снижается каталитическая эффективность), но кажущееся значение КМ остается неизменным. Изме­

нения Км или Vтах' по всей вероятности, обусловле­

ны конформационными изменениями в каталитиче­

ском центре, вызванными связыванием аллостериче­

ского ингибитора в аллостерическом центре. В алло­ стерических ферментах К-ряда эти конформацион­ ные изменения приводят к ослаблению связи между

субстратом и субстратсвязывающими остатками. В аллостерических ферментах V-ряда основной

эффект заключается в изменении ориентации ката­

литичеСIШХ остатков, что приводит к понижению

Vma". Однако могут наблюдаться и промежуточные

случаи, когда конформационные изменения сказы­

ваются и на Км, и на Vm..".

Для описания регуляции аллостерических фер­

ментов были предложены различные модели, однако

вряд ли можно выбрать какую-то одну, способную

объяснить поведение всех регуляторных ферментов.

Поскольку сигмоидный характер кривой насыще­

ния субстратом влечет за собой определенные регу­ ляторные преимущества, любая мутация. приводя­

щая к сигмоидной кривой насыщения, будет иметь тенденцию к закреплению в популяции. Едва ли мо­

жно ожидать, что все эти мутации детерминируют

один и тот же механизм ингибирования. Поэтому

сигмоидность кинетики еще ничего не говорит о ме­

ханизме ингибирования.

ствии ингибитора означает, что относительно малые

изменения концентрации субстрата влекут за собой

большие изменения активности. Это обеспечивает

тонкую регуляцию каталитической активности при

малых изменениях концентрации субстрата. Нако­

нец. как и при насыщении кислородом гемоглоби­

нов разных видов животных, для регулятор­

ных ферментов из разных источников сигмоид­

ные кривые насыщения могут быть сдвинуты влево или вправо; это обеспечиваеr лучшее соответствие

тем концентрациям субстрата. которые преобла­

дают in vi\·o.

Регуляция по принципу обратной связи

в клетках млекопитающих

В клетках млекопитающих, так же как и в бакте­

риальных клетках, конечные продукты регулируют

свой собственный синтез по принципу обратной

связи. В некоторых случаях (в частности, в случае

АТКазы) ингибирование по принципу обратной

связи направлено на первый из ферментов биосинте­

тической цепи. Однако мы должны различать поня­ тия регуляции по IIРИНЦИПУ обратной связи- общий

термин, не содержащий никаких указаний на меха­

низм,-и ингибирования по принципу обратной

связи - механизм регуляции многих ферментов бак­

терий и млекопитающих путем ингибирования. На­

пример, поступающий с пищей холестерол подав­

ляет свой собственный синтез из ацетата в тканях

млекопитающих. Этот тип регуляции, однако, не на­

правлен непосредственно на ингибирование первого

фермента пути биосинтеза холестерола. Ингибиро­

вание затрагивает один из ферментов (HMG-

CoA-редуктазу); функционирующий на ранних ста­

диях биосинтеза механизм включает подавление хо­ лестеролом или его метаболитами экспрессии генов,

кодирующих образование НМG-СоА-редук rазы. Холестерол, непосредственно добавленный в систе­

му с HMG-СоА-редуктазой, никакого действия на ее

каталитическую активность не оказывает.

теризуется высокой, а другое - низкой каталитиче­ ской эффективностью. В зависимости от конкретно­ го случая бо~е активным катализатором может

быть либо фосфо-. либо дефосфофермент (табл. 10.3).

Участки фосфорилирования

Обычно фосфорилируется специфический оста­

ток серина и образуется остаток О-фосфосерина; ре­

же фосфорилируется остаток тирозина с образова­ нием остатка О-фосфотирозина. Хотя обратимо мо­ дифицируемый фермент может содержать много остатков серина или тирозина, фосфорилирование

происходит в высшей степени избирательно и затра­

гивает лишь небольшое число (1-3) остатков. Эти

участки, по всей вероятности, не являются частью

каталитического центра; мы, таким образом, имеем

еще один пример аллостерических эффектов.

Модифицирующие (конвертирующие) ферменты

Фосфорилирование и дефосфорилирование ката­

лизируется протеинкиназами и протеинфосфатазами

соответственно (рис. 10.1 о). В некоторых случаях конвертирующие ферменты сами являются обратимо модифицируемыми ферментами (табл. 10.3). Так, су­ ществуют киназы и фосфатазы протеинкиназы, ката­

лизирующие модификацию конвертирующих белков (протеинкиназ). Данные о принадлежности к обрати­ мо модифицируемым ферментам протеШlфосфатаз ме­

нее убедительны. хотя их активность подвержена ре­

гуляции. Активность протеинкиназ и протеинфосфа­

таз находится под гормональным контролем и регу­

лируется также нервной системой, однако детали ме­ ханизма этой регуляции неясны.

Энергетика

Реакции, представленные на рис. 10.10, подобны

реакциям превращения глюкозы в глюкозо-

6-фосфат или фруктозо-6-фосфата в фруктозо-

1,6-бисфосфат (см. гл. 18). При фосфорилировании

и последующем дефосфорилировании· 1 моля суб­ страта (фермента или сахара) происходит гидролиз 1 моля АТР.

Активность киназ (катализирующих реаКllИИ 1 и 3) и фосфатаз (катал~зирующих реакции 2 и 4) дол­

жна в свою очередь регулироваться - в противном

случае их совместное действие будет приводить к ка­ тализу неконтролируемого гидролиза АТР.

1. Глюкоза + АТР ~ ADP + Глюкозо-6-Р

2.Н2О + Глюкозо-6-Р ~ Р; + Глюкоза

Н2О + АТР ~ ADP + Р;

3.Enz-Ser-OH + АТР ~ ADP + Enz-Ser-O-P

4.Н2О + Enz-Ser-O-P ~ Р; + Enz-Ser-OH