Marri_i_dr_-_Biokhimia_cheloveka_tom_1

Enz + Р

На рис. 8.2] представлена зависимость ]/v от ]j[S] в присутствии и в отсутствие ингибитора (предпола­

гается, что связывание I не приводит к существен­

ным изменениям в работе активного lIентра).

Необратимое неконкурентное ингибирование

Ферментативная активность может уменьшаться

Поток энергии и вещества (в виде атомов углеро­ да) в ходе метаболизма зависит от процессов синтеза

ферментов и активации проферментов. Однако про­ llессы эти необратимы. Как и все белки млекопитаю­

щих, ферменты распадаются на аминокислоты (об­

новление белков). В бактериальных клетках активно­

сть фермента может «разбавляться» из-за распреде­

ления его среди дочерних клеток, образующихся

в результате последовательных делений. Хотя оба

в присутствии многих «ядов», таких, как иодацета­

мид, ионы тяжелых металлов (Ag+, Hg2 +), оки­

сляющие агенты и т. Д. В присутствии одного или

нескольких субстратов или продуктов скорость

инактивации фермента можст снижаться. Тот кине­ тический анализ, о котором здесь шла речь, может

оказаться недостаточным для того, чтобы отличить

действие ферментных ядов от действия неконкурент­

ных обратимых ингибиторов. Обратимое неконку­

рентное ингибирование встречается сравнительно редко. К сожалению, оно не всегда выявляется, по-

механизма приводят к уменьшению концентрации

фермента и как следствие к уменьшению каталитиче­

ской активности, идут такие процессы медленно

и сопровождаются большими затратами вещества:

представим себе по аналогии, что мы выключали бы свет, разбивая лампочку, а затем, чтобы снова его

включить, вкручивали бы новую лампочку. Ясно,

что гораздо эффективнее регулировать активность фермента, «включая» и «выключая» его. Каталити­

ческая aKT~HOCTЬ некоторых ключевых ферментов

действительно регулируется с помощью низкомоле­

кулярных метаболитов (см. гл. 6). Низкомолекуляр­

ные модуляторы, подавляющие ферментативную ак­

о1

[s]

Рис. Н.2). График ЛаЙн)ивсра-Б·)рка ДЛЯ е.'1учая обраш­

могn HCK~lНKYPCH fHnro ингиБИРОRtlНИЯ.

Christensen Н. N. Dissociation, Enzyrne Kinetics, Bioenergetics, Saunders, 1975.

Eng/e Р. С. Enzyme Kinetics, Wiley. 1977.

Piszki»'icz D. Kinetics of Chernical and Enzyrne-Catalyzed Reaetions, Oxford Univ. Press, 1977.

Segel 1. Н. Enzyrne Kinetics. Wiley, 1975.

Sigman D.. S., Mooser G. Chernieal studies of еп~уrnе active sites, Апп. Rev. Biochern., 1975, 44, 889.

Van Ta"'!len Е.Е. (ed.) Bioorganie Chernistry, Vol. 1, Enzyrne AetlOn, 1977; Vol. 2, Maeroand Multirnoleeular Systerns, 1977; Vol. 3, Substrate Behavior. 1978, Academic Press.

ВВЕДЕНИЕ

В этой главе мы детально опишем каталитиче­

.ское действие протеолитического фермента химо­

трипсина, чтобы проиллюстрировать принциnы ка­

тализа, общие для всех ферментов.

БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Чем обусловлены столь высокая каталитическая эффективность ферментов и их специфичность? Это

одна из фундаментальных научных проблем. хотя

некоторые ее аспекты имеют и прикладное значение.

Переход неактивных проферментов в каталитически активное состояние, который наблюдается в клетках

при определенных патологических условиях (напри­ мер, при остром панкреатите), приводит к внутри­ клеточному перевариванию и разрушению тканей. Проводя фундаментальные иследования механизма

действия ферментов, мы в конце концов сможем, используя технологию рекомбинантных ДНК и ме­

тод направленного точечного мутагенеза, система­

тически синтезировать ферменты с более высокой каталитической активностью или новой специфично­ стью. Некоторые из этих «синтетических» фермен­

тов могут оказаться мощными терапевтическими

агентами. Если мы хотим понять, как действуют ме­

таллы на биологические системы, мы тоже должны исследовать их влияние на работу ферментов.

МЕХАНИЗМ КАТАЛИТИЧЕСКОГО

ДЕЙСТВИЯ ХИМОТРИПСИНА

Природа и специфичность полной реакции

Химотрипсин катализирует гидролиз пептидных связе~ в которых карбоксильная группа принадле­ жит ароматической аминокислоте (РЬе, Tyr или Trp) или аминокислоте с объемной неполярной R- группой (Met).

Как и многие другие протеазы, химотрипсин ка­ тализирует также гидролиз некоторых сложных эфи-

ров. Эта его способность не имеет физиологического

значения. но она успешно используется в экспери­

ментах. направленных на детальное изучение меха­

низма катализа.

n-Нитрофенилацетат, полезный

синтетический субстрат

Использование синтетического субстрата n- нитрофенилацетата (рис. 9.1) позволяет определять

активность химотрипсина колориметрическими ме­

тодами. поскольку гидролиз n-нитрофенилацетата приводит к образованию n-нитрофенола. КОТОРЫЙ

в щелочной среде превращается в имеющиЙ желтую

окраску n-нитрофенолят-анион.

Изучение кинетики методом остановленной

струи

Кинетику гидролиза n-нитрофенилацетата химо­

трипсином можно изучать с помощью так называе­

мого метода остановленной струи. Метод состоит

всмешивании примерно эквимолярных количеств

фермента и субстрата и немедленном (в течение не­

сколько миллисекунд) измерении. Растворы реаген­

тов заливают в два шприца и с помощью механиче­

ского устройства одновременно и практически мгно­ венно выталкивают их в очень узкую трубку. прохо­

дящую через спектрофотометр. На экран осцилло­

графа выводятся данные об оптической плотности

как функции времени. прошедшего с момента сме­

шивания.

Рис.. 9.1. n-НИ1роФеНЮ13цетат.

ВреМА, МС

Рис. 9.1. Кинетика освобождения n-нитрофенолят-аниона в ходе гидролиза I1-НИТРОФСНИЛiluстата хи:\-ютрипсином. рс­ гистрируемая методом остановленной струи. Количество

выделившегося n-нитрофСНО.'Ia опредсляется путем ИЗ:\lерения оптической пжпности.

Двухфазный характер гидролиза n-нитрофенилацетата

Кинетическая кривая образования n-

нитрофенолят-аниона имеет две четко различаю­ щиеся фазы (рис. 9.2): 1) фаза «выброса». характери­

нитрофенолят-аниона.: 2) последующее медленное

образование еше некоторого количества n-

нитрофенолят-аниона.

Образование и распад фермент-субстратного

комплекса

Двухфазный характер образования n-

нитрофеНОJIят-аниона можно объяснить, рассматри­

вая последовательныle стадии катализа, приведенные

на рис. 9.3.

Медленная стадия представляет собой гидролиз химотрипсин-ацетатного комплекса (ХТ-Ац). После того как весь имеющийся химотрипсин перейдет

в состав комплекса, выделение n-нитрофено­

лят-аниона замедлится из-за отсутствия свободного

фермента, который освобождается лишь по мере

медленного отщепления от комплекса ацетат-иона

(рис. 9.3). Фаза «выброса» n-нитрофенолят-аниона

(рис. 9.2) соответствует переходу всего имеющегося

Фенол

ХТ+ ПНф__-t.~ХТ-пНф~ХТ-Дц

ХТ-ПНФ' и ацстилфсрмента XT-Arl идет намного быстрее

гидролиза ХТ-Ац.

Рис. 9.4. Реакция rи:tроксила Scr 195 в сост,ше хиvю 1 рипси­ на с диизопропи:rфторфосфатом (ДИфф).

химотрипсина в состав комплекса ХТ-Ац с одновре­

менным образованием n-нигрофенолят-аниона. Ос­

вобождение -этого продукта сразу вслед за быстрой

фазой обусловлено медленным высвобождением хи­

мотрипсина в процессе гидролиза комплекса ХТ-Ац. Этот свободный химотрипсин снова включается

в реакцию образования комплексов ХТ-ПНФ и

ХТ-Ац, сопровождающуюся выделением n-нитро­

фенолят-аниона. Количество выделившегося n-нит­ рофенолят-аниона прямо пропорционально числу

молей химотрипсина, присутствующего в смеси.

Роль Ser 195 в катализе

Ацильная группа, входящая в состав интермедиа­

та ацил-ХТ, связана с высокореакционноспособным

остатком серина-Sег 195. Особая роль и высокая

реакционная способность Ser 195 проявляется в спо­ собности этого остатка (отсутствующей у остальных

27 сериновых остатков химотрипсина) вступать в ре­

акцию с диизопропилфторфосфатом (ДИФФ) (рис. 9.4). Аналогичные реакции характерны и для других

сериновых протеаз.

При модификациии Ser 195 химотрипсин инакти­ вируется. По аналогичному механизму в присут­ ствии ДИФФ происходит инактивация и ряда других протеаз. Все они называются сериновыми протеаза­

ми.

Система переноса заряда

В ходе катализа в молекуле химотрипсина функ­

ционирует система переноса заряда, которая служит

каналом переноса протона. Эта система включает

три аминокислотных остатка, далеко отстоящих

друг от друга в первичной структуре, но сближенных в рамках третичной структуры до расстояний. допу­ скающих возможность взаимодействия. Этими

остатками являются Asp 102, His 57 и Ser 195. Хотя

в химотрипсине большинство заряженных остатков

находится на поверхности молекулы, остатки, из ко­

торых формируется система переноса заряда, укры­

ты во внутренней неполярной части молекулы. Три

упомянутых остатка образуют цепочку Asp 102 ...

О

11 _ ~

Рис. 9.5. Функционирование системы переноса протонов

в ХИМОТРИПСИIIС при ацилировании остатка Ser 195 субстра­ том (Суб-).

Напомним, что Ser 195-это тот самый остаток,

который в ходе катализа подвергается ацилирова­

нию. Сближение ацетат-аниона (образующегося из n-нитрофенилацетата) с атомом кислорода R- группы Ser 195 приводит к последовательному пере­

носу протона от Ser 195 к His 57 и далее к Asp 102

(рис. 9.5).

В ходе деацилирования комплекса ацил-Sеrl95 протон перемещается в обратном направлении. Ана­

логичный перенос протона, как полагают, происхо­

дит и при гидролизе физиологических субстратов хи­

мотрипсина - пептидов.

РОЛЬ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО ПРОТЕОЛИЗА

В ФОРМИРОВАНИИ АктивныIx

ЦЕНТРОВ ФЕРМЕНТОВ

Превращение ПРОХИМОТРИПСlIна в химотрипсин

Прохимотрипсин - это полипептид, состоящий из 245 аминокислотных остатков. Его превращение

в активный фермент, а-химотрипсин, начинается

с протеолитического разрыва, приводящего к обра­

зованию каталитически активного 1t-химотрипсина

(п-хт), коrорый далее протеолитически расщепля­

ется еще в трех местах (рис. 9.6).

В а-химотрипсине цепи А, В и С (рис. 9.6) оста­

ются связанными друг с другом двумя межцепочеч­

ными дисульфидными связями (рис. 9.7).

Проферменты

Многие белки синтезируются и секретируются

в форме неактивных белков-предшественников, ко­

торые называют пробелками. В тех случаях, когда

белки являются ферментами, пробелки называют проферментами или зимогенами. Превращение про-

белка в зрелый белок осуществляется путем избира­ тельного протеолиза. В пробелке происходит один

или несколько последовательных протеолитических

разрывов, посл.е чего появляется характерная для

зрелого белка активность (например, ферментатив­ ная). К числу белков, синтезируемых в виде пробел­

ков, относятся гормон инсулин (его пробелком

является проинсулин), пищеварительные ферменты пепсин, трипсин и химотрипсин (пробелки-

пепсиноген, трипсиноген и химотрипсиноген), неско­

лько факторов каскаДН~IХ систем свертывания крови

и растворения кровяного сгустка (см. гл. 55), белок

соединительной ткани коллаген (пробелок-

проколлаген).

Почему некоторые белки секретируются в неак­ тивной форме? Дело в том. что есть два типа белков. Одни из них необходимы практически постоянно, надобность же в других (например, ферментах, уча­ ствующих в образовании и растворении кровяного сгустка) возникает лишь эпизодически. Однако когда в этих, в норме отсутствующих, ферментах возни­ кает реальная потребность, они оказываются необ­ ходимыми немедленно. Некоторые физиологические

процессы, например пищеварение, тоже не идут не­

прерывно, но они более или менее регулярны И пред­ сказуемы (правда, у первобытного человека это мо­

гло быть и не так). В других случаях (например, при

образовании кровяного сгустка, при его растворении

или при восстановлении поврежденной ткани) фи­

зиологические процессы являются непосредственной

реакцией на внезапно возникшие физиологические

потребности организма или патологические

состояния. Понятно, что процессы образования кро-

13 1415f16+--______146--=--__149---=-_____~24~5 Про-ХТ

Рис. 9.6. Схема превращсния прохимотрипсина (про-ХТ) в П-ХIfМОТРИПСИIl (п-ХТ) и далее 11 зрелый. катаЛJlТИЧССКИ активный u-хи!\.ютрипсин (и-ХТ).

вяного сгустка и его растворения должны быть

скоординированы, чтобы был достигнут гемостаз.

Наконец. следует указать. что синтез протеаз в виде

каталитически неактивных предшественников защи­

щает ткани, в которых они синтезируются (напри­

мер. ткань поджелудочной железы), от самоперева­

ривания (такое самопереваривание наблюдается при

панкреатите).

Синтез новых белков, потребность в которых

обусловливается патологическими факторами (на­

пример, потерей крови), может осуществляться до­

вольно быстро. ОmШКО ДJlя этого необходимо, чтобы

имелся соответствующий и достаточно полный пул

аминокислот; кроме того, процесс секреции может

ОКClзаться слишком медленным, чтобы удовлетво­ рить внезапно возникшую физиологическую потреб­ ность в том ИЛИ ином белке.

Рассмотрим общие принципы превращения про­

белка в зрелую. физиологически активную форму.

1. Процесс включает избирательный протеолиз,

в некоторых случаях он сводится к осуществлению

единственного протеолитического разрыва.

2. Полипептидные продукты могут далее функ­

ционировать как индивидуальные молекулы или же

могут оставаться ассоциированными друг с другом

УПОРЯДОЧЕННОЕ ИНЕУПОРЯДОЧЕННОЕ СВЯЗЫВАНИЕ СУБСТРАТОВ

Многие ферменты катализируют реакцию между

двумя и более субстратами, в результате КОТОРОЙ

образуется один или несколько продуктов. Для про­ текания одних ферментативных реакций необходимо одновременное присутствие всех субстратов. В дру­

гих случаях фермент сначала взаимодействует с од­

ним субстратом, а затем катализирует его реакцию

с другим субстратом. Связывание субстратов может

происходить неупорядоченныM или упорядоченным

образом (рис. 9.8).

Многие ферментативные реакции, требующие обязательного присутствия коферментов, проте­ кают по «челночному» механиз~у, при котором фер­

мент попеременно находится в состояниях Е и Е'

(рис. 9.9 и 9.10).

Хотя кофермент часто может рассматриваться

как второй субстрат, некоторые коферменты кова­ лентно связываются с ферментом или связываются

нековалентно, но настолько прочно, что диссоциа­

ции практически не наблюдается (тиаминпирофос­ фат). В этих случаях мы считаем; что ферментом служит весь фермент-коферментный комплекс.

взрелой форме белка.

3.Процесс можег (но необязательно) сопрово­

ждаться значительными изменениями молекулярной

массы.

4. Главным следствием избирательного протео­ лиза является изменение конформации молекулы.

5. Если пробелок превращается в фермент, то указанные выше конформационные изменения иг­

ФЕРМЕНТЫ КАК КАТАЛИЗАТОРЫ ОБЩЕГО КИСЛОТНОГО И ОБЩЕГО ОСНОВНОГО ТИПА

После связывания субстрата в области каталити­

ческого центра заряженные (или способные нести за­

ряд) функциональные группы боковых цепей могут

рают важную роль в формировании каталитическо­ го центра фермента. В этом смысле избирательный протеолиз профермента можно рассматривать как процесс запуска конформационных изменений, обе­

спечивающих формирование каталитического цен­

тра.

Обратите внимание, что остатки His 57 и Asp 102

находят~я в составе В-пептида а-химотрипсина, тог­

дCl как Ser 195 -в С-пептиде (рис. 9.6). Таким обра­ зом, избирательный протеолиз прохимотрипсина

(химотрипсиногена) обеспечивает сближение трех

остатков, участвующих в переносе заряда. Этот при­

мер наглядно показывает, как с помощью избирате­

льного протеолиза может формироваться каталити­ ческий центр. Следует еще отметить, что каталити­

ческие остатки и остатки субстратсвязывающего

центра, попадая в разные полипептидные цепи, тем

не менее оказываются на таких расстояниях друг от

друга, при которых они могут взаимодействовать

с субстратом.

НеУПОРRдоченное

Е~ЕА--4ЕАВ-ЕРа~::QLЕ

УПОРRдоченное

Рис. 9.8. Неупорядоченное и упорядоченное пгисосдинсние сvбстратов А и В к феР\1еf1ТУ и высвобождение продуктов р и Q из комплекса с ферментом Е.

тивного кислотно-основного катализа: общий ки­

слотный (или основный) и специфический кислотный (или основный).

Реакции, скорость которых изменяется при изме­

нении концентрации ионов Н+ или Н)О+, но не за­

висит от концентрации других кислот или основа­

ний, присутствующих в растворе, рассматриваются

как реакции, осуществляемые в результате специфи­ ческого кислотного или специфического основного ка­

тализа. Реакции, скорость которых зависит от при­ сутствия в растворе любых кислот (доноров прото­ нов) и любых оснований (акцепторов протонов).

рассматриваются как реакции, осуществляемые в ре­

зультате общего кислотного или общего основного ка­

тализа.

Для того чтобы решить, какой именно катализ

имеет место в данной ферментативной реакции­ общий или специфический кислотный или основ­

ный,- нужно измерить скорость реакции в следую­

щих условиях: 1) при различных рН, но при постоян­

ной концентрации буфера; 2) при фиксированном рН, но при различных концентрациях буфера.

Еслискорость реакции при постоянной концентра­

ции буфера изменяется с изменением рН, то имеет место специфический ОСИОВНЫЙ катализ (при рН > 7)

или специфический кислотный катализ (при рН < 7).

Если же скорость реакции при фиксированном рН возрастает с повышением концентрации буфера, то

осуществляется общий основный катализ (при рН > 7) или общий кислотный катализ (при рН < 7).

В качестве примера специфического кислотного

катализа рассмотрим превращение субстрата S

в продукт Р. Реакция протекает в две стадии: за бы­

строй стадией. вк'лючающей обратимый перенос

протона:

S + Н)О+ +t SH+ + Н2О.

следует более медленная, лимитирующая скорость

всего процесса стадия превращения протонирован­

ного субстрата в продукт:

SH+ + Н2О +t Р + Н)О+.

Повышая концентрацию ионов гидрония [НзО+], мы повышаем концентрацию SH + -

сопряженной кислотной формы субстрата; поско-

d[P]

Скорость реакции = -- = k [SH +].

dt

где Р- продукт, 1 - время. k - удельная константа скорости, [SH +] - концентрация сопряженной ки­

слотной формы субстрата.

Поскольку концентрация SH + зависит одновре­

менно от конuентраций S и НзОf • общее выражение

для скорости реакuии, катализируемой по типу спе­

цифического кислотного катализа. примет вид

d[P] = k' [S] [Н 0+].

Обратите внимание на свойственную специфическо­

му кислотному катализу особенность: в выражение

для скорости реакции входят только члены [S]

и [Н)О+].

Рассмотрим теперь в дополнение к описанному

выше специфическому кислотному катализу также

и катализ, осуществляемый ионом имидазолия ими­

дазольного буфера. Поскольку имидазол- это сла­

бая кислота (рК.. ~ 7), он является плохим донором

протонов; поэтому реакция

S + Имидазол Н+ -+ SH + + Имидазол

протекает медленно и лимитирует скорость полной

реакции. Отметим, что быстрая и медленная стадии

в случаях специфического и общего кислотного ката­

лиза меняются местами. Выражение для скорости

реакции в случае общего кислотного катализа часто

имеет довольно сложный вид и поэтому здес~ не

рассматривается.

ИОНЫ МЕТАЛЛОВ

Свыше 25% всех ферментов содержат прочно

связанные ионы металлов или активны только в их

присутствии. Для изучения функuий ионов металлов

используются методы рентгеновской кристаллогра­

фии, ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и элек­

тронного парамагнитного резонанса (ЭПР). В соче­ тании со сведениями об образовании и распаде ме-

таллсодержащих комплексов и о реакциях, в кото­

рых затрагивается координационная сфера ионов

металлов, данные, полученные 31 ими методами, по­

зволяют лучше понять роль ионов металлов в фер­

ментативном катализе. Об этой роли и говорится

ниже.

Металлоферменты и ферменты,

активируемые металлами

Металлоферменты содержат определенное коли­

Комплексы с мостиковым ферментом

(M-Enz-S)

Металлы в комплексах с мостиковым фермен­

том, по-видимому, выполняют структурную роль,

поддерживая активную конформацию (примером служит глутаминсинтаза), или образуют мостик

с другим субстратом (как в пируваткиназе). В пиру­

ваткиназе ион металла играет не только структур­

ную роль, но и удерживает один из субстратов (АТР)

и активирует его:

чество ионов металлов, имеющих функциональное значение и остающихся связанными с молекулой

фермента в ходе его очистки. Ферменты, активируе­

мые металлами, связывают последние менее прочно,

но для своей активности требуют добавления метал­

лов в среду. Таким образом, разграничение между металлоферментами и ферментами, активируемыми металлами. основано на сродстве данного фермента к иону «своего» металла. Механизмы, основанные на участии ионов металлов в катализе, 8 обоих случаях,

по-видимому, сходны.

Тройные комплексы фермент- металл-

субстрат

/~

Пируваткиназа -АТР

'Креатин.

Комплексы с мостиковым субстратом

Образование тройных комплексов с мостиковым

субстратом, которое наблюдается при взаимодей­

ствии ферментов с нуклеозидтрифосфатами, по­

видимому, связано с выстеснением Н2О из координа­

ционной сферы металла, место которой занимает

АТР:

Для тройных (трехкомпонентных) комплексов, включающих каталитический центр (Enz), ион ме­ талла (М) и субстрат (S) со стехиометрией 1: 1: 1, воз­

можны четыре различных схемы образования:

Enz-S-M M-Enz-S

Комплекс с мостиковым Комплекс с мостиковым

Затем субстрат связывается с ферментом, образуя

тройной комплекс:

АТР-М(Н2О)2) + Enz ~

~Enz-ATP-M(H20)2).

вфосфотрансферазных реакциях ионы металлов, как полагают, активируют атомы фосфора и обра­

зуют жесткий полифосфат-адениновый комплекс

в соответствующей конформации, который вклю­

чается в состав активного четырехкомпонентного

комплекса.

в случае ферментов, активируемых мета.'Iлами,

реализуются все четыре схемы. Для металлофермен­

тов образование комплекса Enz - S- М невозмо­ жно, иначе они не могли бы удерживать металл

впроцессе очистки (они находятся в форме Enz-

-М). Можно сформулировать три общих правила.

1.Большинство (но не все) киназ (АТР:фосфо­ трансферазы) образуют комплексы с мостиковым субстратом типа Enz -нуклеозид-М.

2.Фосфотрансферазы, использующие в качестве

субстрата пируват или фосфоенолпируват, другие

ферменты, катализирующие реакции с участием фосфоенолпирувата, а также карбоксилазы обра­

зуют комплексы с мостиковым металлом.

З. Данный фермент может быть способен к обра­

зованию мостикового комплекса одного типа с од­

Комплексы с мостиковым металлом

М

/

Епz-М-SипиЕпz", I

S

Кристаллографические данные, а также анализ первичной структуры показывают, что в активных

центрах многих белков в связывании металла уча­

ствует остаток гистидина (примерами служат кар­

боксипептидаза А, цитохром с, рубредоксин, мет­ миоглобин и метгемоглобин; см. гл. 6). Лимитирую­

щей стадией образования бинарных (двухкомпо­ нентных) комплексов Enz- М во многих случаях

является вытеснение воды из координационной сфе­

ры иона металла. Активация многих пептидаз иона­

ми металла является медленным процессом,

Связывание Jwеталла'

Быстрая

стадия

Перестройка с образованием активной конформации

(Enz*):

МедЛенная

стадия

в случае металлоферментов образование тjюйно­

го комплекса с мостиковым металлом должно про-·

исходить путем присоединения субстрата к бинарно­

му комплексу:

м

Enz-M + S;:::: Епz-М-SипиЕпz/ I

"- S

Роль металлов в катализе

Ионы металлов могут участвовать в каждом из

четырех известных типов механизмов, с помощью

!' Из работы Mildvan Д. S.: Metals in епzуmе catalysis. Vol. 2, р. 456 in: fnzymes, Вoyer Р. О., Lardy Н., Myrblick К. (editors). дса­

demic Press. 1970, с изменениями.

ра металла может обеспечивать контактирование

фермента и субстрата (сближение) либо путем обра­

зования хелатов переводить фермент или субстрат

в напряженное состояние. Ион металла может ма­

скировать нуклеофил, предотвращая побочные реак"

которых ферменты ускоряют химические реакции: 1) общий кислотно-основный катализ; 2) ковалентны~

катализ; 3) сближение реактантов; 4) индукция на­ пряжения в ферменте или субстрате. Помимо ионов железа, которые функционируют в гемсодержащих

белках, в ферментативном катализе чаще всего уча­

ствуют Mg2+, Мп2 + и СаН, хотя в работе некото­

рых ферментов важную роль играют и другие ионы

(например, К+).

Ионы металлов, как и протоны. являются льюи­ совыми кислотами (электрофилами) и могут образо­ вывать со своими лигандами Б-связь за счет поде­

ленной электронной пары. Ионы металлов можно

рассматривать также как «сверхкислоты», поскольку

они устойчивы в нейтральном растворе, часто несут положительный заряд (> 1) и способны к образова­ нию л-связей. Кроме того (в отличие от протонов),

металлы могут служить трехмерной матрицей, ориентирующей основные группы фермента или суб­

страта.

Ионы металлов могут функционировать как ак­ цепторы электронов с образованием Ь- или л-связей,

активируя электрофилы или нуклеофилы (общий ки­

слотно-основный катализ). Металлы могут активи­

ровать нуклеофилы, отдавая электроны, или же сами

действовать как ну.клеофилы. Координационная сфе-

ции. Наконец, возможен стереохимический контроль хода ферментативной реакции, который обеспечи­ вается способностью координационной сферы ме­

талла играть роль трехмерной матрицы, удержи­

вающей реагирующие группы в нужной простран­ ственной ориентации (табл. 9.1).

ЛИТЕРАТУРА

Crane F. Hydroquinone dehydrogenases, Annu. Rev. Biochem.• 1977, 46, 439.

Fersht А. Enzyme Structure and Mechanism, 2nd ed., Frecman,

1985. [Имеется перевод l-го издания: Фёршт Э. Струк­

тура и механизм действия ферментов.- М.: Мир,

1980.]

Kraиt J. Serine proteases: Structure and mechanism of catalysis. Лппи. Rev. Biochem., 1977, 46, 331.

Mildvan А. S. Mechanism of enzyme action, Лппи. Rev. Biochem., 1974, 43, 357.

Purich D. L. (ed.) Enzyme kinetics and mechanisms. Parts А and В. In: Methods in Enzymology, Yol. 63, 1979; Yol. 64, 1980, Лсаdеmiс Press.

Wimmer М. J.. Rose 1. А. Mechanisms of enzyme-catalyzed group transfer reactions. Лппи. Rev. Biochem.• 1978. 47, 1031.

Wood Н. G., Barden R. Е. Biotin enzymes. Лппи. Rev. Biochem., 1977, 46, 385.

ВВЕДЕНИЕ

В этой главе мы рассмотрим на нескольких при­

мерах механизмы регуляции метаболических про­ цессов, в которых участвуют ферменты. При этом мы постараемся обрисовать общую картину регуля­

ции. В дальнейшем в этой книге мы не раз встре­

тимся и со многими другими примерами, иллюстри­

рующими многообразие процессов регуляции мета­

болизма.

выше областей биомедицины, связанная с действием лекарств: здесь мы тоже обнаруживаем множество

примеров, свидетельствующих о важности процес­

сов регуляции работы ферментов. В частности,

известно, что введение некоторых лекарств приво­

дит к усилению синтеза ряда ферментов (эти лекар­ ства действуют как индукторы ферментов). Напри­ мер, фенобарбитал приводит к значительному (в 3 - 5 раз) увеличению содержания микросомного фер­ мента IIитохрома Р-450, который играет централь­

БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Механизмы, посредством которых клетки и це­

лые организмы координируют и регулируют весь на­

бор метаболических процессов, представляют инте­ рес для ученых, работающих в самых разных обла­ стях биомедицинских наук. Сюда можно отнести проблемы канцерогенеза, сердечно-сосудистых забо­ леваний, старения, физиологии микроорганизмов, диффереНIIИРОВКИ, метаморфоза, действия гормонов и лекарственных препаратов. Во всех этих областях

наблюдаются примеры нарушений регуляции рабо­

ты ферментов, имеющие важное медицинское значе­

ние. Например, изучение экспериментальных опухо­

лей показывает, что во многих раковых клетках на­

блюдаются нарушения регуляции, приводящие к из­ менению пропорций при образовании ферментов (отcyrствие их индукции или репрессии). Эго подтвер­

ждает хорошо известное положение, согласно кото­

рому одним из фундаментальньiх признаков рако­

вых клеток является нарушение системы генетиче­

ского контроля. Или другой пример: некоторые он­ когенные вирусы содержат ген, кодирующий тирози­

новую протеинкиназу; когда эта киназа экспресси­

руется в клетках хозяина, она фосфорилирует мно­

гие белки и ферменты' которые в норме не фосфори­

лированы, что приводит к серьезным изменениям

клеточного фенотипа. Изменения подобного харак­

тера, по-видимому, лежат в основе целой категории клеточных трансформаций, вызываемых онкогенны­

ми вирусами. И наконец. последняя из упомянутых

и многих других лекарственных препаратов. Один из

таких препаратов- варфарин. препятствующий

свертыванию крови. Если больной принимает вар­

фарин, а затем ему назначают фенобарбитал, то до­

за варфарина должна быть существенно увеличена,

чтобы компенсировать его разрушение под дей­

ствием индуцированного цитохрома P-4S0. Индук­

ция ферментов- это один из важных биохимиче­ ских механизмов взаимообусловленного действия

лекарств, когда прием одного препарата сопровож­

дается значительным изменением в метаболизме

другого.

РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА

Гомеостаз

Представление о гомеостатической регуляции

внутренней среды было введено Клодом Бернаром в конце XIX в. Эта способность животного поддер­

живать постоянным состав внутриклеточной среды

означает, что все необходимые ферментативные ре­

акции протекают со скоростями, соответствующими

изменениям внутренней среды организма и его окру­

жения. Клетку или организм можно считать больны­

ми, если они неадекватно реагируют на внутреннее

или внешнее воздействие. Чтобы понять механизмы

гомеостаза нормальных клеток и выяснить молеку­

лярные основы различных заболеваний, важно пред­

ставить, от каких факторов зависят скорости фер­

ментативных реакций.

Общак картина реrулкции метаболизма

Для нормального функционирования организма

должна осуществляться точная регуляция потока

метаболитов по анаболическим и катаболическим

путям. Все сопутствующие химические процессы

должны протекать со скоростями, отвечающими

требованиям организма как целого· в условиях OKPY~ жающей среды. Генерация АТР, синтез макромоле­ кул, транспорт, секреция, реабсорбция в почеч­

НbIX канальцах до~жны чутко реагировать на самые

небольшие изменения в окружении, в котором нахо­ дится клетка, орган, животное. Эти процессы долж­ ны быть скоординированы и отвечать на изменения во внешней среде (например, на поступление пи­

тательных веществ или их удаление), а также

у бактерий. Тем не менее мы все же рассмотрим эти вопросы именно для бактерий. поскольку это позво­

лит нам охарактеризовать общие принципы регуля­

ции, которые сохраняют свое значение и при изуче­

нии процессов регуляции у человека.

Способы реrуляции работы ферментов

Поток углерода, «проходящий» через ту или иную ферментативную реакцию, можно регулиро­ вать, изменяя следующие параметры: 1) абсолютное

количество присутствующего фермента; 2) пул ре­

агентов (помимо фермента); 3) каталитическую эффективность фермента. Большинство форм жизни

использует все три типа регуляции.

на периодически происходящие внутриклеточные

события (например', репликацию ДНК). До недавнего

времени детали регУ,ляции на молекулярном уровне

изучались только на бактериях; у этих организ-

1 Легко обратимаи реакции характеризуетси малым по

асболютной величине 11 t1. Реакции с большим отрицатель­

ным 11 G дли большинства биохимических систем могут считатьси практически необратимыми.

1 При этом, однако, наблюдаютси кратковременные колебании концентраций метаболитов и содержании фер­ ментов, которые имеют важное физиологическое значение.

РЕГУЛЯЦИЯ КОЛИЧЕСТВА ФЕРМЕНТА ПУТЕМ РЕГУЛЯЦИИ СКОРОСТИ ЕГО СИНТЕЗА И РАСПАДА

Общие принципы

Абсолютное количество фермента в клетке опре­ деляется скоростями его синтеза (kсинт) и распада (kp8cn) (рис. 10.2). Соответственно количество фер­ мента увеличивается либо в результате повышения скорости его синтеза (увеличением kсиит), либо сниже­

ния скорости распада (уменьшением kpacn), либо

обоими способами сразу. Подобным же образом ко-