2. Обнаружение вируса.

Вируссодержащий материал вносят в 1-е лунки двух рядов микропланшета по 0,025 мл. Во все остальные лунки этих рядов, включая и первые лунки, добавляют по 0,025 мл 0,85 % раствора хлорида натрия. Делают раститровку вируса, как описано выше. Далее во все лунки первого ряда вносят по 0,025 мл известной иммунной сыворотки против предполагаемого вируса, в разведении 1:20. Во второй ряд (контроль) вносят по 0,025 мл растворителя. Смесь оставляют на 30 мин при 37^о С, затем во все лунки двух рядов добавляют по 0,025 мл 1 % взвеси эритроцитов курицы. Учет реакции ведут через 60 мин экспозиции при 37^о С.

В контрольном ряду вирусная гемагглютинация будет наблюдаться, например, до 8-ой лунки. В опыте могут быть два варианта. Если гемагглютинирующий вирус не соответствует по специфичности сыворотке, то в этом случае титр гемагглютинации в первом ряду лунок будет соответствовать второму ряду. Если вирус гомологичен известной иммунной сыворотке, то произойдет из взаимодействие, следовательно, взаимная нейтрализация, Поскольку ГВ в этих лунках не будет, это проявится укорочением числа лунок с реакцией гемагглютинации в первом ряду, по сравнению с лунками второго ряда. Например, в 1 ряду гемагглютинация составит 5 лунок.

Реакция применяется в вирусологических исследованиях для поиска антител или вируса в соответствующем материале.

Метод гашения действия.

Метод основан на нейтрализации вируса и его болезнетворного действия.

РН - реакция нейтрализации.

Для проведения метода требуются

1. Вирус с выраженной инфекционной активностью.

2. Антисыворотка известная или исследуемая.

3. Биологический объект (лабораторное животное, культуры тканей, эмбрионы).

4. Растворители (физиологический раствор при работе с животными, среда 199, Игла, Эрла - для работы с культурой клеток).

Вируссодержащий материал (ВСМ) предварительно титруют, определяя конечное разведение, которое может вызвать повреждение тканей или инфицирование животных или эмбрионов.

Готовят 10-кратные разведения ВСМ в пробирках, используя для каждого разведения отдельную пипетку. Для этого, в пробирки вносят 1 мл растворителя и в первую пробирку 0,1 мл ВСМ. Из первой пробирки переносят во вторую 0,1 мл вируссодержащей жидкости, перемешивают, переносят 0,1 мл в третью и т.д. Каждое разведение вируса из пробирки вносят в несколько лунок, содержащих пласт клеток, по 0,2 мл. Наблюдают за культурой клеток 2-3 суток. Титр вируса выражают в 50 % дозе - ТКИД50, это гибель 50 % клеток.

Постановка опыта. В пробирках делают последовательные разведения испытуемых сывороток в объеме 0,5 мл. Во все лунки вносят по 100 ТКИД ВСМ, выдерживают смесь 1-2 ч при комнатной температуре, затем каждое разведение вносят в пласт клеток в лунках. Если вирус был нейтрализован антителами, то размножения в культуре не последует - это проявится отсутствием ЦПД (цитопатического действия). Там, где вирус оставался нативным, отмечено ЦПД.

Вариант с животными. Например, проводят выявление антител в сыворотках людей с подозрением на бешенство. К 10-кратным разведениям ВСМ в пробирках добавляют равный объем исследуемой сыворотки в разведении 1:10. Параллельно делают контрольный ряд (нормальная сыворотка). Пробирки оставляют на 1 ч при 37^о С. Смесь вводят в мозг молодым взрослым белым мышам и наблюдают 30 суток. Мыши, зараженные смесью вируса с антителами, не болевают, а зараженные смесью вируса с нормальной сывороткой погибают от энцефалита.

Цветная проба. Антисыворотки смешивают с вирусом по 0,4 мл (ТКИД50). Через 2 ч вносят 0,2 мл смеси в лунку с культурой клеток и наслаивают сверху вазелин 0,2 мл для изоляции от кислорода воздуха. На протяжении 6-8 дней регистрируют изменение цвета среды. В лунках, где был внесен нейтрализованный вирус, цвет среды изменится от красного к желтому. Там, где вирус был живым, клетки погибли, а цвет среды оставался красным.

Феномен иммуноконъюгации

Основан на конъюгации метки разной природы на одном из компонентов реакции антиген-антитело или на дополнительном агенте.

РИА - радиоиммунологический анализ.

Прямой метод.

В лунки двух рядов полистироловых планшет вносят исследуемый на антиген экстракт, в концентрации 0,05 мкг, выдерживают 12 ч при комнатной температуре, отмывают планшет физиологическим раствором, содержащим 5 % по объему фосфатного буфера и 2 % твина-20. В качестве конъюгата используют иммунный глобулин, который соответствует по специфичности предполагаемому антигену, меченный J ¹²⁵.

Вносят конъюгат во все лунки двух рядов. Выдерживают 60 мин при 37^о С, трижды отмывают растворителем и определяют дозаторами остаточную долю связавшейся метки, против той, которая была на конъюгате.

Непрямой метод.

Полистироловые планшеты, применяемые для ИФА, нагружают антигеном в рабочей дозе (предварительно выбирается доза, связывающая 50 % метки). Для этого, растворимый антиген (вируссодержащую жидкость) заливают в лунки микротитратора пипетками по 0,1 мл и оставляют на ночь при комнатной температуре. На другой день лунки с антигеном трижды отмывают растворителем для удаления свободного антигена.

В лунки с сорбированным антигеном вносят по 0,1 мл разведения испытуемой на антитела сыворотки. Разведения сыворотки предварительно готовят в пробирках и по 0,1 мл вносят в лунки планшета, начиная с последней пробирки (вносят в последнюю лунку) и т.д. Планшету оставляют на 40 мин при 37^о С, трижды отмывают растворителем для удаления свободных компонентов сыворотки.

Предварительно готовят конъюгат. Из антисыворотки кроличьей против сывороточных белков человека получают глобулин, путем высаливания 40 % сульфатом аммония. От соли глобулин очищают одним из методов, например, пропуская через сефадекс G50. Затем этот глобулин добавляют к смеси J ¹²⁵ и хлорамина Т в равных объемах, через 2 мин реакцию останавливают с помощью NaHSO₃ и проводят разделение меченого глобулина и свободных компонентов на сефадексе-G25. Меченый глобулин консервируют 0,2 % азида натрия.

Заранее приготовленный конъюгат вносят во все лунки планшет по 0,1 мл, выдерживают в течение 40 мин при 37^о С, а затем трижды отмывают лунки растворителем. Далее в лунках плпншет следует проводить определение доли связанного йода по сравнению с количеством его в конъюгате.