1. Изолирование

1. Объектами исследования при ХТА могут быть как сами ядохимикаты, так и биологические объекты – желудок с содержимым, печень, почки в смертельных случаях отравления и биологические жидкости – кровь, моча – у живых лиц при установлении диагноза острого отравления, а при санитарно-гигиенических исследованиях – пищевые продукты, почва, вода.

Изолирование из внутренних органов трупа основано на настаивании измельченных органов с 3-х кратным объемом смеси: ацетон-этанол-вода (1,5:1,5:1) при рН 5-5,5 в течение 4 часов с последующим экстрагированием хлороформом.

Изолирование из биологических жидкостей проводят при рН 5 прямой экстракцией хлороформом с последующей концентрацией извлечения.

Обнаружение и определение

Тонкослойная хроматография в анализе ФОП – второй по значимости метод. По сравнению с методом ГЖХ он менее чувствителен и специфичен, не дает точной количественной оценки, но преимущество его в том, что он не требует специальной аппаратуры и, при необходимости, может быть использован в любой лаборатории.

Метод ТСХ используется для очистки и разделения ФОП, идентификации и ориентировочного количественного определения.

Для хроматографирования используют пластины «Silufol», либо стеклянные пластины с силикагелем, фиксированным гипсом. Хроматограммы развивают в одной из систем растворителей: 1. гексан-ацетон 4:1; 2. бензол.

Общая проба на ФОП

На пластину наносят 2 точки метчика с содержанием смеси ФОП 10 и 20 мкг (для ориентировочного количественного определения) и аликвоту извлечения. Хроматографируют в одной из систем, затем проявляют, последовательно обрабатывая пластину:

1. Парами брома – наблюдают буро-коричневые пятна (не специфична, дают соэкстрактивные вещества);

2.Спиртовым раствором железа (III) хлорида и кислоты сульфосалициловой

наблюдают пятна желтого или белого цвета (фосфат-ион).

При положительном результате общей пробы на ФОП устанавливают класс ФОП.

Определение класса ФОП

На три хроматографические пластины наносят аликвоты экстрактов, как в общей пробе. После хроматографирования пластины обрабатывают следующим образом: 1-ю пластину (на серусодержащие ФОП) с палладия хлоридом, наблюдают пятно желтого цвета, либо с серебра нитратом и бромфеноловым синим, при этом наблюдают пятно лилового цвета (после обесцвечивания фона кислотой лимонной).

2-ю пластину (на ФОП с нитрофенильным радикалом) опрыскивают спиртовым раствором едкого натрия. При наличии в пятне свободных нитрофенолов (метаболиты) – желтая окраска появляется сразу, в присутствии ФОП с нитрофенильным радикалом – желтая окраска появляется после нагревания.

3-ю пластину (на хлорофос и дихлофос) обрабатывают щелочным раствором резорцина, наблюдают пятна, окрашенные в розовый цвет.

Пятна, выявленные во всех случаях, сравнивают с пятнами метчика. При совпадении Rf искомого ФОП с Rf метчика выполняют подтверждающие реакции и проводят ориентировочное количественное определение по площади пятна. Содержание ФОП рассчитывают по формуле:

А  S²  где Х - содержание ФОП в объекте (мкг/кг)

Х = В  S¹ А - содержание ФОП в стандарте (мкг)

В - навеска пробы в г с учетом аликвоты

S¹ - площадь пятна метчика (мм²)

S² - площадь пятна пробы (мм²)

При положительном результате общей пробы на ФОП определяют степень угнетения холинэстеразы крови.

1. Холинэстеразная проба(энзимное экспозиционно-колориметрическое определение) – основана на способности ФОП угнетать активность фермента холинэстеразы. При угнетении холинэстеразы нарушается регулирование разложения ацетинхолина, что приводит к его накоплению и непрерывному раздражению нервных клеток. Как следствие, нарушаются функции ЦНС и вегетативной НС. Это приводит к тяжелейшим расстройствам - судорогам, параличам, бронхоспазму, угнетению дыхания и сердечной деятельности.

+ холинэстераза +

(CH3)3-NCH2CH2OCOCH3  (CH3)3-NCH2CH2OH + HOCOCH3

ацетилхолин холин уксусная кислота

В норме ацетилхолин под влиянием фермента холинэстеразы разрушается с образованием холина и уксусной кислоты, в результате чего изменяется рН смеси ацетилхолин + холинэстераза.

Изменение рН можно зафиксировать с помощью кислотно-основных индикаторов, например, бромтимолового синего. Изменение окраски в контроле (от синей к желтой) происходит в течение 10-15 минут. В присутствии ФОП (как антихолинэстеразных веществ) окраска индикатора не изменяется более продолжительное время, чем в контроле.

Угнетение активности холинэстеразы рассчитывают в % по формуле:

100  Т  где Т - время изменения окраски в контрольной пробе

Х = 100 - Т¹ Т¹ - время изменения окраски в исследуемой пробе

Угнетение активности холинэстеразы более чем на 10 %, указывает на возможное присутствие в пробе ФОП.

Экстрактивные вещества органов трупа, крови, мочи без глубокого гнилостного разложения не мешают определению. Продукты гниения могут снижать активность холинэстеразы на 10-50 %. В этом случае проводят предварительную очистку пробы на колонке с активированным углем.

Холинэстеразная проба неспецифична, используется как предварительный, ориентировочный тест, не имеющий отрицательного судебно-химического значения.