Лукашева_Е.В._Материалы_к_лекциям_по_биохимии_соединительной_ткани (2)

Внеклеточные этапы процессинга

А. Отщепление С- и N-концевых пептидных последовательностей

Внеклеточные специфичные протеиназы, отщепляют на N- и С- концах последовательности аминокислот с молекулярной массой 20 и 30-35 кДа, соответственно. Образовавшуюся трехспиральную молекулу коллагена часто называют

тропоколлагеном.

При низком уровне активности специфических протеиназ концевые пептиды не отщепляются, что препятствует дальнейшему формированию фибрилл коллагена и приводит к развитию синдрома Эйлерса-Данло-Русакова: снижению роста, искривлению позвоночника, частым вывихам, высокой растяжимости кожи.

Б. Формирование фибрилл незрелого коллагена

Образованные молекулы тропоколлагена содержат примерно 1000 аминокислотных остатков в каждой цепи и собираются в коллагеновые фибриллы, неотличимые по внешнему виду от вполне зрелых фибрилл, присутствующих в тканях. Образование фибрилл происходит вблизи клеточной поверхности, часто в глубоких складках плазматической мембраны, что может влиять на скорость и ориентацию молекул при сборке фибрилл. Особенностью структурной организации фибрилл является параллельное расположение тройных спиралей тропоколлагена, причем на стыках молекулы тропоколлагена не примыкают друг другу вплотную, между ними остаются промежутки длиной в 3540 нм. При такой величине этого промежутка продольное расположение молекул повторяется через каждые пять рядов, так что, например, молекулы в рядах 1 и 6 лежат точно друг против друга.

11

В. Окисление аминогрупп лизильных остатков до альдегидов и образование внутри- и межмолекулярных сшивок между полипептидными цепями

Образовавшиеся фибриллы не являются зрелыми, не обладают прочностью зрелых коллагеновых фибрилл, и требуется образование дополнительных связей, укрепляющих взаимодействие между молекулами коллагена. В дальнейшем прочность фибрилл сильно возрастает благодаря созданию ковалентных сшивок между остатками лизина внутри коллагеновых молекул и между ними. Ковалентные связи такого типа встречаются только в коллагене и эластине. Если блокировать их образование, содержащие коллаген ткани становятся хрупкими, и такие структуры, как кожа, сухожилия и кровеносные сосуды будут легко разрываться. Количество и тип сшивок изменяются от ткани к ткани. Например, в ахилловом сухожилии, для которого прочность на разрыв очень важна, такие сшивки в коллагене особенно многочисленны.

Чтобы обеспечить создание укрепляющих связей, необходимо наличие в полипептидных цепях реакционноспособных альдегидных групп. Внеклеточный медьзависимый фермент лизилоксидаза катализирует реакцию превращения в коллагене и эластине ε-аминогрупп отдельных лизильных и гидроксилизильных остатков в альдегидные группы:

Модифицированные остатки лизина называются аллизином, поскольку вместо ε-аминогрупп они содержат

13

альдегидные группы. Молекула лизилоксидазы состоит из двух доменов: медь-связывающего и каталитического, содержащего в качестве кофермента тирозилхинон, который в ходе ферментативной реакции образует комплекс с аминокислотными остатками лизина. Этот обнаруженный сравнительно недавно кофермент образуется в результате постсинтетической модификации аминокислотного остатка тирозина в полипептидной цепи фермента. Экспериментальные данные показывают, что его образование происходит в молекуле синтезированного белка в аэробных условиях в присутствии ионов меди без добавления каких-либо дополнительных молекул. На экспрессию лизилоксидазы влияет ряд ростовых факторов, ангиотензин II, ретиноевая кислота, а также последствия стресса от повреждения тканей.

Возникшие в результате реакции окислительного дезаминирования альдегидные группы участвуют в образовании ковалентных внутри- и межмолекулярных связей, которые стабилизируют фибриллы коллагена. Альдольная конденсация двух аллизиновых остатков приводит к формированию сшивки лизин-норлейцин (см. схему - а), а путем взаимодействия лизильного и альлизильного остатков образуются альдиминные связи, называемые также основаниями Шиффа (см. схему -б):

14

Сшивки, образованные тремя или четырьмя остатками лизина, называются пиридиновыми или пиридинолиновыми (если сшивки образуют аминокислотные остатки гидроксилизина, их называют гидроксипиридинолиновыми), поскольку они включают пиридиновое кольцо.

На следующем далее рисунке схематически представлены трехспиральные молекулы тропоколлагена после наложения внутри и межмолекулярных сшивок, которые изображены в виде стрелок.

Трехспиральные молекулы тропоколлагена

Гидроксигруппы

Углеводные

компоненты

Внутри и межмолекулярные сшивки

15

При недостаточно высокой активности лизилоксидазы, а также при явных нарушениях обмена меди в организме

образуется недостаточное число поперечных сшивок между белковыми цепями, в результате чего снижается прочность коллагеновых фибрилл и развивается наследственное заболевание cutis laxa (вялая кожа), сопровождающееся непрочностью кожи, сухожилий, кровеносных сосудов.

Имеется определенная зависимость между возрастом человека и количеством поперечных сшивок. С возрастом количество сшивок увеличивается, обновление молекул коллагена замедляется, и ткани становятся более грубыми.

В фибриллообразующих типах коллагенов после превращения незрелых фибрилл в зрелые путем формирования сшивок, фибриллы укладываются параллельно друг другу (на схеме слева), и далее они объединяются в коллагеновое волокно (на схеме справа).

Около 95% коллагенов организма (I, II, III, V и XI типа) объединяются в фибриллы и составляют структурную основу органов и тканей, которые испытывают сильную механическую нагрузку, таких как кости, зубы, хрящи, кровеносные сосуды. Нужно отметить, что некоторые типы коллагена (IV, VIII, Х) образуют не фибриллярные, а сетеподобные структуры. О способах укладки молекул коллагена, а также о заболеваниях,

16

связанных с нарушениями синтеза и созревания коллагена можно прочитать в разделе 15 учебника «Биохимия» под ред.чл.- корр.РАН, проф. Е.С.Северина, М.: издательский дом «ГЭОТАР-

МЕД», 2003.

1.2. Уровни структурной организации коллагена

А. Первичная структура цепей коллагенов сильно отличается от аминокислотных последовательностей других белков, поскольку представляет собой повторение трех аминокислотных остатков: (гли-Х-У)n , где Х и У – любые аминокислотные остатки, кроме глицина. Особенности первичной структуры коллагенов состоят в том, что: а) каждый третий аминокислотный остаток представлен глицином; б) из приблизительно 1000 аминокислотных остатков, входящих в состав молекулы коллагена, около 100 Х-положений занято пролином и около 100 У-положений – 4-гидроксипролином, кроме того, на каждую молекулу приходится около 100 остатков аланина; в) в Х-положениях содержится 3-гидроксипролин, а в У- положениях – 5-гидроксилизин.

Б. Вторичная структура коллагена представлена не правозакрученной, как у многих других белков, а левозакрученной α-спиралью, в которой на один виток приходятся три аминокислотных остатка (в правозакрученной α- спирали на один виток приходятся 3,6 аминокислотных остатков), и все остатки глицина находятся по одну сторону этой спирали, которая отличается еще и тем, что она более вытянута – шаг спирали составляет не 0,54 нм, а 0,96 нм. У такой растянутой спирали невозможно образование водородных связей между атомами кислорода карбонильных групп и атомами водорода, связанными с участвующим в образовании пептидных связей атомами азота.

В. Третичная структура коллагена

За счет того, что три левозакрученные спирали собираются в одну тройную (правозакрученную) спираль, формируется третичная структура коллагена. Поскольку глицин является

17

наименьшим по размеру среди других аминокислотных остатков и не имеет боковых радикалов, остатки глицина всех трех цепей коллагена располагаются в центре тройной суперспирали, образуя ее внутреннюю часть (см. рис. на стр.10).

Дополнительную стабильность тройной спирали (тропоколлагену) придает наличие большого количества остатков пролина, вокруг которых невозможно врaщение полипептидной цепи, и остатков гидроксипролина, образующего внутримолекулярные водородные связи. Кроме того, третичная структура коллагена стабилизируется большим количеством сшивок, возникающих как результат действия на лизильные остатки фермента лизилоксидазы. Внешний вид молекулы тропоколлагена напоминает стальной трос.

Г. Четвертичная структура коллагена – способ укладки молекул тропоколлагена в пространстве в виде фибриллярных структур. Процесс формирования фибрилл коллагена называется фибриллогенезом.

Коллагеновые фибриллы имеют разную толщину и поразному организуются в различных тканях. Например, в коже они расположены наподобие прутьев в плетеных корзинах, и поэтому сопротивляются нагрузкам по всем направлениям. В сухожилии они собраны в параллельные пучки, уложенные вдоль главной оси, а в зрелой костной ткани и роговице глаза их расположение напоминает чередующиеся слои в фанере – фибриллы каждого слоя уложены параллельно друг другу почти под прямым углом к фибриллам соседних слоев. Клетки участвуют в организации секретируемых ими коллагеновых белков: фибробласты воздействуют на выработанный ими коллаген, передвигаясь вдоль него и одновременно растягивая его, что способствует уплотнению слоев и вытягиванию волокон.

1.3. Регуляция метаболизма коллагена и ее нарушения

Время полужизни коллагена в организме довольно продолжительно: от нескольких недель до нескольких месяцев в зависимости от типа коллагена и возраста человека. Глюкокортикоиды тормозят рибосомальный синтез коллагена, уменьшая уровень мРНК препроколлагена, а также снижают

18

активность лизил- и пролилгидроксилазы. Недостаточное гидроксилирование влечет за собой уменьшение гликозилирования молекул коллагена и делает их более доступными для действия коллагеназы и неспецифических протеиназ, что приводит к ускорению распада. Синтез коллагена зависит также от активности половых гормонов, снижение уровня которых приводит к остеопорозу и уменьшению содержания коллагена.

Тормозящее действие по механизму обратной связи на скорость синтеза коллагена оказывают сам коллаген и отщепляемые N-концевые пептиды препроколлагена после их отщепления.

Распад (катаболизм) коллагена происходит под действием внеклеточных металлопротеиназ, синтез которых индуцируют специфические цитокины. Основной металлопротеиназой, осуществляющей протеолиз коллагена является Zn2+-зависимая, специфичная по отношению к этому белку, протеиназа (коллагеназа), активаторами которой являются плазмин, калликреин и катепсин D, а ингибитором – тканевый ингибитор протеиназ. Этот фермент секретируется остеокластами, полиморфноядерными нейтрофилами, эпителиальными клетками, фибробластами и макрофагами. Коллагеназа «разрезает» тройную спираль коллагена строго специфично между остатками глицина и лейцина на расстоянии от С-конца, приблизительно равном четверти длины всей молекулы. Образовавшиеся пептиды наделены регуляторными свойствами: они могут активировать в клетках синтез новых молекул коллагена. Катаболизм этих пептидов происходит путем последующего расщепления тканевыи протеиназами. Кроме коллагеназы в гидролизе коллагена могут принимать участие металлозависимые протеиназы - катепсин D и катепсин В1, действие которых приводит к образованию пептидов, не наделенных способностью активировать синтез коллагена. Причиной усиления распада коллагена может также являться замедление синтеза тканевого ингибитора металлопротеиназ.

Пиридиновые сшивки между полипептидными цепями коллагена I типа на неспирализованных С- и N- концах тропоколлагенна устойчивы к деградации и высвобождаются при

19

распаде коллагена в виде связанных с ними пептидов – так называемых С- и N- телопептидов, которые довольно редко (из-за необходимости использовать дорогостоящее оборудование) используются как маркеры распада коллагена I типа.

Основным маркером распада коллагена (т.е. важнейшим метаболитом, характеризующим скорость распада коллагена) является гидроксипролин – аминокислота, синтезируемая путем посттрансляционного гидроксилирования пролиновых остатков в составе коллагена. 85-90% гидроксипролина, освобождающегося в результате гидролитического расщепления коллагена, метаболизируется в печени под действием гидроксипролиноксидазы. На долю гидроксипролина, выводящегося в неизмененном виде с мочой, приходится только 10-15%. У молодых людей обмен коллагена происходит быстро и содержание гидроксипролина в моче может достигать 200 мг/сут. С возрастом увеличивается количество поперечных сшивок между молекулами, цепи становятся недоступными для тканевых протеиназ, и обмен коллагена замедляется, что приводит к снижению суточной экскреции гидроксипролина до 15-20 мг/сут.

Повышение количества гидроксипролина в плазме крови и моче (до 1 г/сут) может наблюдаться при тяжелых формах пародонтита, гиперпаратиреозе, коллагенозах и недостаточном синтезе фермента катаболизма гидроксипролина - гидроксипролиноксидазы.

Увеличение отношения концентрации пролина к концентрации гидроксипролина в плазме крови свидетельствует о нарушении гидроксилирования и созревания коллагена.

Нарушения синтеза и распада коллагена могут приводить к развитию патологий, связанных с повышенной ломкостью и деформацией костей, гиперподвижностью суставов, аномалиями зубов, а также поражениями кишечника, почек, легких, сердца, сосудов. Среди многих поражений соединительной ткани особое место занимают коллагенозы. Для них характерно повреждение всех структурных составных частей соединительной ткани: волокон, клеток и межклеточного матрикса. Коллагенозы наблюдаются при ревматизме, ревматоидном артрите, системной красной волчанке и некоторых других заболеваниях. Каждое из

20