Genetika_cheloveka_Shevchenko

сочетании с другими методами генетического анализа.

Популяционностатистический метод

Одним из важных направлений в современной генетике является популяционная генетика. Она изучает генетическую структуру популяций, их генофонд, взаимодействие факторов, обусловливающих постоянство и изменение генетической структуры популяций. Под популяцией в генетике понимается совокупность свободно скрещивающихся особей одного вида, занимающих определенный ареал и обладающих общим генофондом в ряду поколений. (Генофонд — это вся совокупность генов, встречающихся

уособей данной популяции).

Вмедицинской генетике популяци- онно-статистический метод используется при изучении наследственных болезней населения, частоты нормальных и патологических генов, генотипов и фенотипов в популяциях различных местностей, стран и городов. Кроме того, этот метод изучает закономерности распространения наследственных болезней в разных по строению популяциях и возможность прогнозировать их частоту в последующих поколениях.

Популяционно-статистический метод используется для изучения:

а) частоты генов в популяции, включая частоту наследственных болезней; б) закономерности мутационного

процесса; в) роли наследственности и среды в

возникновении болезней с наследственной предрасположенностью;

г) влияния наследственных и средовых факторов в создании фенотипического полиморфизма человека по многим признакам и др.

Таблица 2.3. Наследуемость некоторых признаков человека, определенная близнецовым методом

Использование популяционно-ста- тистического метода включает правильный выбор популяции, сбор материала и статистический анализ полученных результатов.

В основе метода лежит закономерность, установленная в 1908 г. английским математиком Дж. Харди и немецким врачом В. Вайнбергом для идеальной популяции. Обнаруженная ими закономерность получила название закона Харди — Вайнберга.

Для идеальной популяции характерны следующие черты: большая численность, свободное скрещивание (панмиксия) организмов, отсутствие отбора и мутационного процесса, отсутствие миграций в популяцию и из нее. В идеальной популяции соотношение частоты доминантных гомозигот {АА), гетерозигот {Аа) и рецессивных гомозигот {аа) сохраняется постоянным из поколения в поколение, если никакие эволюционные факторы не нарушают это равновесие. В этом основной смысл закона

Харди-Вайнберга. При изменении любой из перечисленных черт соотношение численности генотипов в популяции нарушается. Факторы, стимулирующие сдвиг равновесия, — родственные браки, мутации, дрейф генов, отбор, миграции и другие. Закон Харди-Вайнберга является основой при рассмотрении генетических преобразований, происходящих в естественных и искусственно созданных популяциях растений, животных и человека.

Соотношение численности разных генотипов и фенотипов в панмиктической популяции определяется по формуле бинома Ньютона:

(p + q)' = p2 + 2pq + qJ; (p+q) = 1,

где р — частота доминантного аллеля A, q — частота рецессивного аллеля а, рг — частота генотипа АА (гомозигот по доминантному аллелю), q — частота генотипа аа (гомозигот но рецессивному аллелю)

И, следовательно, в соответствии с законом Харди-Вайнберга частота доминантных гомозигот (АА) равна квадрату вероятности встречаемости доминантного аллеля, частота гетерозигот (Аа) — удвоенному произведению вероятности встречаемости доминантного и рецессивного аллелей. Частота встречаемости рецессивных гомозигот (аа) равна квадрату вероятности рецессивного аллеля.

Таким образом, популяционно-ста- тистический метод дает возможность рассчитать в популяции человека частоту нормальных и патологических ге- нов-гетерозигот, доминантных и рецессивных гомозигот, а также частоту нормальных и патологических фенотипов, т.е. определить генетическую структуру популяции.

Рассмотрим конкретный пример:

В одном из городов при обследовании на резус-фактор 16 % людей оказалась резус-отрицательными и 84 % — резус-положительными. Известно, что резус-положительный фактор обусловлен доминантным аутосомным геном С, а резус-отрицательный фактор — рецессивным геном с. Носители резусположительного фактора могут иметь генотип СС или Сс. Чтобы определить, какая часть из них гомо- и гетерозиготна, используем формулу Харди-Вайн- берга:

р'СС: 2pq Сс: q'cc = 1

Гомозиготы по рецессивному аллелю _составляют 16% или 0,16; отсюда q = >75716 - 0,40 (или 40 %). Итак, частота рецессивного аллеля в популяции составляет 40%. Как определить частоту доминантного аллеля? Исходя из того, что p + q = l , a q = 0,40, то р = 1 — 0,40 = 0,60 или 60 %. Процент в популяции зигот СС и Сс вычисляем следующим образом:

СС = р2 = (0,60)2= 0,36 или 36%; Сс = 2pq = или 2 х 0,60 х 0,40 = 0,48 или 48 %.

Следовательно, среди обследованного населения положительный резусфактор имели 36 % с генотипом СС и 48 % с генотипом Сс. В итоге 84 % населения были резус-положительными, а 16% — резус-отрицательными (сс).

Подобные расчеты широко используются в медико-генетических исследованиях популяций. Вместе с тем следует отметить, что в малочисленных популяциях человека закон Хар- ди-Вайнберга не применим, т.к. статистические закономерности, на которых он основан, не имеют значения в случае малых чисел.

Важным фактором, влияющим на частоту аллелей в малочисленных по-

пуляциях и в изолятах являются гене-

тико-автоматические процессы или дрейф генов. Это явление было описано в 30-хх гг. Н.П. Дубининым и Д.Д. Ромашовым (СССР) и С.Райтом

иР.Фишером (США). Оно выражается в случайных изменениях частоты аллелей, не связанных с их селекционной ценностью и действием естественного отбора. Из-за дрейфа генов адаптивные аллели могут быть элиминированы из популяции, а менее адаптивные и даже патологические (в силу случайных причин) могут сохраниться

идостигнуть высоких концентраций.

Врезультате в популяции может происходить быстрое и резкое возрастание частот редких аллелей.

Генетико-автоматические процессы наиболее интенсивно протекают при неравномерном размножении особей в популяции. Колебания численности популяции нередко наблюдается у насекомых, грызунов и других животных в виде т.н. "волн жизни". В отдельные благоприятные годы численность их сильно возрастает, а затем резко падает. Причинами могут быть развитие эпидемических заболеваний, нехватка пищи, понижение температуры и др. В результате спада численности (или в изолированных популяциях) уменьшается гетерозигогность и возрастает генетическая однородность популяции.

Примером действия дрейфа генов в человеческих популяциях может служить "эффект родоначальника". Он наблюдается, если структура популяции формируется под влиянием аллелей ограниченного числа семей. В таких популяциях нередко наблюдается высокая частота аномального гена, сохранившегося в результате случайного дрейфа генов. Возможно, что следствием дрейфа генов является разная

частота резус отрицательных людей в Европе (14 %) и в Японии (1 %), неравномерное расЛространение наследственных болезней по разным группам населения земного шара. Например, в некоторых популяциях Швеции широко распространен ген ювенильной амавротической идиотии, в Южной Африке — ген порфирии, в Швейцарии — ген наследственной глухоты и др.

Близкородственные браки (инбридинг) значительно влияют на генотипический состав популяции. Такие браки чаще всего заключаются между племянницей и дядей, между двоюродными братом и сестрой. Близкородственные браки запрещены во многих странах из-за высокой вероятности рождения детей с наследственной патологией : родственники, имея общее происхождение, могут быть носителями одного и того же рецессивного патологического гена, и при браке двух здоровых гетерозигот вероятность рождения больного ребенка становится высокой.

Новые гены могут поступать в популяцию в результате миграции (потока генов), когда особи из одной популяции перемещаются в другую и скрещиваются с представителями данной популяции. Реальные популяции редко бывают полностью изолированными. Всегда происходит некоторое передвижение особей из одной популяции в другую. Такое передвижение может быть не только активным, но и пассивным (перенос семян птицами). Иногда человек умышленно перемешивает популяции. Например, в Сибири для улучшения местных соболей в их популяции выпускают баргузинскйх соболей с очень темной окраской меха, более ценимой в меховой промышленности. Это приводит к изменению час-

тоты аллелей в основной популяции и среди "иммигрантов". В локальных популяциях частота аллелей может изменяться, если у "старожилов" и пришельцев исходные частоты аллелей различны. Аналогичные процессы происходят и в человеческих сообществах.

В США потомство от смешанных браков между белыми и неграми относится к негритянскому населению. По данным Ф. Айала и Дж. Кайгера (1988) частота аллеля, контролирующего резус-фактор у белого населения, составляет 0,028. В африканских племенах, от которых происходит современное негритянское население, частота этого аллеля равна 0,630. Предки современных негров США были вывезены из Африки 300 лет (около 10 поколений) назад. Частота аллеля у современного негритянского населения Америки составляет 0,446. Таким образом, поток генов от белого населения к негритянскому шел со скоростью 3,6 % за 1 поколение. В результате через 10 поколений доля генов африканских предков составляет сейчас 0,694 общего числа генов современного негритянского населения США. Около 30 % генов американские негры унаследовали от белого населения. Очевидно, поток генов между белым и негритянским населением был значительным.

Наконец, следует рассмотреть кратко, как влияют на генетическую структуру популяций мутационный процесс и отбор. Мутации, как фактор эволюции, обеспечивают приток новых аллелей в популяцию. По изменению генотипа мутации подразделяют на генные (или точковые), внугрихромосомные и межхромосомные, геномные (изменение числа хромосом.). Генные мутации могут быть прямыми

(А>а) и обратные (а>А). Частота возникновения прямых мутаций значительно выше обратных. Одни и те же гены могут мутировать многократно. Кроме того, один и тот же ген может изменяться в несколько аллельных состояний, образуя серию множественных аллелей (А>а„ а2, a,... ak). Изучение частоты мутаций у человека, обусловливающих такие тяжелые болезни, как гемофилия, ретинобластома, пигментная ксеродерма и др. дают основания полагать, что частота возникновения патологических мутаций отдельного гена составляет около 1-2 на сто тысяч гамет за поколение. Учитывая общее количество генов у человека (около 100 тыс.), суммарная мутабильность — величина немалая.

Частота мутаций может значительно возрасти при действии на организм некоторых физических и химических факторов — мутагенов. Химические мутагены обнаружены среди промышленных ядов, инсектицидов, гербицидов, пищевых добавок и лекарств. Большинство канцерогенных веществ также обладают мутагенным действием. Кроме того, многие биологические факторы, например, вирусы, живые вакцины, а также гистамин, стероидные гормоны, вырабатываемые в организме человека, могут вызывать мутации. Сильными мутагенами являются различные виды излучений (рентгеновские лучи, гамма — лучи, а и |}-час- тицы, нейтроны и др.), способные продуцировать генные и хромосомные мутации у человека, о чем свидетельствуют последствия аварии на Чернобыльской АЭС (см. главу 6).

К факторам, нарушающим постоян- • ство генетической структуры популяций, относится и естественный отбор, вызывающий направленное изменение генофонда путем элиминации из попу-

ляции менее приспособленных особей или снижения их плодовитости. Рассмотрим влияние отбора на примере доминантной патологии — ахондроплазии (карликовости). Эта болезнь хорошо изучена в популяциях Дании. Больные имеют пониженную жизнеспособность и умирают в детском возрасте, т.е. устраняются естественным отбором из популяции. Выжившие карлики редко вступают в брак и имеют мало детей. Анализ показывает, что около 20 % генов ахондроплазии не передаются от родителей детям, а 80 % этих генов элиминируются из популяции. Из этих данных следует, что ахондроплазия не оказывает существенного влияния на структуру популяции.

Большинство мутантных генотипов имеют низкую селекционную ценность и попадают под действие отбора. По данным В. Маккьюсика (1968) среди мутантов около 15 % плодов погибают до рождения, 3 % — умирают, не достигнув половой зрелости, 20 % умирают до вступления в брак, в 10% случаев брак остается бесплодным.

Однако не каждый мутантный ген снижает селективную ценность признака. В ряде случаев патологический ген в гетерозиготном состоянии может повышать жизнеспособность особи. В качестве примера рассмотрим серповидноклеточную анемию. Известно, что это заболевание распространено в странах Африки и Азии. У людей, гомозиготных по аллелю HbS, вырабатывается гемоглобин, отличный от нормального, обусловленного аллелем HbS. Гомозиготы HbSHbS погибают, не достигнув половозрелости. Гетерозиготы HbAHbS более устойчивы к малярии, чем нормальные гомозиготы HbAHbA и HbSHbS. Поэтому в районах распространения болезни гетерозиготы имеют селективное преимущество.

Отбор работает в пользу гетерозигот. В районах, где не было малярии, гомозиготы HbAHbA обладают одинаковой приспособленностью с гетерозиготами. При этом отбор направлен против рецессивных гомозигот. В некоторых районах Африки гетерозиготы составляют до 70 %. населения. "Платой" за приспособленность к условиям существования служит т.н. генетический груз, т.е. накопление вредных мутаций в популяции.

Цитогенетический метод

Основа метода — микроскопическое изучение хромосом человека. Цитогенетические исследования стали широко использоваться с начала 20-х гг. XX в. для изучения морфологии хромосом человека, подсчета хромосом, культивирования лейкоцитов для получения метафазных пластинок.

Развитие современной цитогенетики человека связано с именами цитологов Д.Тио и А.Левана. В 1956 г. они первыми установили, что у человека 46 (а не 48, как думали раньше) хромосом, что положило начало широкому изучению митотических и мейотических хромосом человека.

В1959 г. французские ученые

Д.Лежен, Р.Тюрпен и М. Готье установили хромосомную природу болезни Дауна. В последующие годы были описаны многие другие хромосомные синдромы, часто встречающиеся у человека. Цитогенетика стала важнейшим разделом практической медицины. В настоящее время цитогенетический метод применяется для диагностики хромосомных болезней, составления генетических карт хромосом, изучения мутационного процесса и других проблем генетики человека.

В1960 г. в г. Денвере (США) была разработана первая Международная

классификация хромосом человека. В ее основу легли размеры хромосом и положение первичной перетяжки — центромеры. Все хромосомы по форме разделены на метацентрические, субметацентрические и акроцентрические и подразделены на 7 групп, обозначенных латинскими буквами А, В, С, D, Е, F и G. Каждая пара хромосом была наделена порядковым номером от 1 до 22, выделены отдельно и поименованы латинскими буквами — X и Y половые хромосомы (Табл. 2.4).

В 1971 г. на IV Пражской конференции генетиков в дополнении к Денверской классификации были представлены методы дифференциальной окраски хромосом, благодаря которым каждая хромосома приобретает свой неповторимый рисунок, что помогает точной идентификации.

Основные сведения о морфологии хромосом человека получены при изучении их в метафазах митоза и профа- зе-метафазе мейоза. При этом важно, чтобы количество делящихся клеток, было достаточно высоко. Важнейшие цитогенетические работы выполнены на лимфоцитах периферической крови, поскольку культивирование лимфоцитов в течение 2-3 суток в присут-

ствии фитогемагглютинина позволяет получить множество метафазных пластинок для хромосомного анализа.

Цитогенетическому анализу подвергают однослойные метафазные пластинки с раздельно лежащими хромосомами. Для этого делящиеся клетки обрабатывают колхицином и некоторыми другими химическими веществами (гипотоническим раствором солей, метанол-уксусным фиксатором и др.).

Важным этапом цитогенетического анализа является окраска полученных препаратов. Ее проводят простыми, дифференциальными и флюоресцентными методами.

Простая окраска обеспечивает групповую идентификацию хромосом. Используется она для количественного учета хромосомных аномалий при определении мутагенности среды (действия радиации, химических мутагенов и др.). С помощью этого типа окраски были открыты многие хромосомные болезни, а также хромосомные аберрации), вызывающие самопроизвольные аборты, врожденные пороки развития, канцерогенез и т.п.

В 70-е гг. XX в. в медицинской практике начали применяться методы диф-

ференциального окрашивания, выявляющие структурную разнородность хромосом по длине, что выражается в виде чередования светлых и темных нолос (эу- и гетерохроматических районов). Отмечается, что протяженность и рисунок полос специфичны для каждой хромосомы.

Дифференциальное окрашивание хромосом можно проводить рядом способов. Первоначально использовали акрихиниприт — флюоресцентное алкилирующее вещество (Q-метод). Действие его основано на способности метафазиых хромосом дифференциально связывать флюорохромы. После окрашивания акрихин-ипритом сегменты приобретают яркое флюоресцирующее свечение. Для просмотра таких препаратов используют люминесцентный микроскоп.

В дальнейшем был разработан способ окраски хромосом без флюоресцентных красителей. Это — G-окраска (краситель Гимза). После предварительной инкубации в солевом растворе хромосомы обрабатываются протеазой. В результате они приобретают сегментированный вид благодаря чередованию темно и светлоокрашенных участков. Механизм образования сегментов пока недостаточно ясен. Предполагается, что окрашенные сегменты — это гетерохроматиновые участки с повторяющимися последовательностями ДНК, а неокрашенные — эухроматиновые районы с кодирующими последовательностями ДНК (рис. 2.9).

К разновидностям дифференциального окрашивания по методу Гимзы относятся R-окрашиваемость и С-ок- рашиваемость. Эти разновидности дифференциального окрашивания получают при определенном изменении времени инкубации препаратов, окрашенных по методу Гимзы. В нер-

вом случае распределение окрашенных и неокрашенных сегментов будет обратным тому, что наблюдается при G и Q-окрашивании. На R-окрашен- ных хромосомах гетерохроматиновые и околоцентромерные районы остаются светлыми. В случае же С-окрас- ки выявляются районы структурного гетерохроматина, наиболее устойчивого к химическим и физическим повреждениям. В аутосомах и Х-хромо- сомах человека эти районы локализованы в околоцентромерных участках, а в Y-хромосоме — в дистальной половине длинного плеча. Наиболее крупные блоки С-хроматина имеются в аутосомах 1, 9 и 16 в области их вторичных перетяжек, а также в Y-хромосо- ме. Самыми мелкими центромерными блоками обладают Y-хромосома и аутосома 2 (рис. 2.10).

Одной из особенностей хромосом человека является асинхронность (неодновременность) репликации по длине. В каждой хромосоме есть рано и поздно реплицирующиеся участки. Для выявления последовательности репликации применяется 5-бромдезоксиури- дин — аналог тимина. Включившие его участки окрашиваются слабо.

Применяется 5-бром-дезоксиури- дин и для дифференциальной окраски сестринских хроматид, если он вводится на полный клеточный цикл. В этом случае вновь образуемая хроматида, включит этот аналог тимина и будет окрашена слабо, а другая (старая) окрасится интенсивно (рис. 2.11). Этот метод позволяет выявлять участки обмена между сестринскими хроматидами (СХО).

При воздействии различными мутагенными факторами число СХО увеличивается, следовательно, этот метод пригоден для изучения мутационного процесса у человека.

И И U

13-15

I Ь « h |

1 9 - 2 0

Успехи молекулярной цитогенетики человека позволяют разрабатывать новые методы изучения хромосом. Так, следует отметить метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH), который дает возможность исследовать широкий круг вопросов : от локализации гена до расшифровки сложных перестроек между несколькими хромосомами. Метод FISH может применяться и для диагностики анеуплоидий в интерфазных ядрах (см. главу 6).

Таким образом, соединение цитогенетических и молекулярно-генетиче- ских методов в генетике человека делает почти неограниченными возможности диагностики хромосомных аномалий.

Метод генетики соматических клеток

Тот факт, что соматические клетки несут в себе весь объем генетической информации, дает возможность изу-

чать на них генетические закономерности всего организма.

Основу метода составляет культивирование отдельных соматических клеток человека и получение из них клонов, а так же их гибридизацию и селекцию.

Соматические клетки обладают рядом особенностей:

-быстро размножаются на питательных средах;

-легко клонируются и дают генетически однородное потомство;

-клоны могут сливаться и давать гибридное потомство;

-легко подвергаются селекции на специальных питательных средах;

-клетки человека хорошо и долго сохраняются при замораживании.

Соматические клетки человека получают из разных органов — кожи, ко-

стного мозга, крови, ткани эмбрионов. Однако чаще всего используют клетки соединительной ткани (фибробласты)

илимфоциты крови.

Спомощью метода гибридизации соматических клеток:

а) изучают метаболические процессы в клетке;

б) выявляют локализацию генов в хромосомах;

в) исследуют генные мутации; г) изучают мутагенную и канцеро-

генную активность химических веществ.

В 1960 г. было показано, что совместно культивируемые клетки различных линий могут сливаться, образуя гибриды, содержащие геномы обеих родительских форм. Первые такие гибриды были получены при слиянии клеток