Получение тканевой первичной культуры.

На первом этапе получения первичной культуры происходит стерильное удаление фрагмента ткани животного и его механическая или ферментативная дезинтеграция. Ткань может быть просто измельчена до мелких кусочков, которые прикрепляются поверхности чашки благодаря собственной адгезивности, наличию насечек на чашке или с помощью сгустка плазмы. В этих случаях будет происходить рост клеток из фрагментов и клетки, мигрирующие из эксплантатов, могут использоваться для пассирования. Таким образом, например, можно получать культуру клеток дермы - фибробластов.

Первичная культура может быть также получена путём дезинтеграции тканей ферментами, например трипсином или коллагеназой. Клетки образующейся при этом суспензии оседают, прикрепляются и распластываются на поверхности стекла или пластика. Так получают клетки эпителия, некоторые клетки эмбрионов.

Субкультивирование первичной культуры.

После того, как первичная культура достигнет состояния монослоя, она может быть перенесена во второй культуральный сосуд после диссоциации клеток монослоя трипсином и разведения, т.е. пересеяна или субкультивирована.

Для суспензионных культур в случае субкультивирования достаточно только разведения.

Диссоциация клеток монослойной культуры достигается промыванием монослоя фосфатным солевым буфером (ФСБ) или ФСБ с 1 мМ этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) и последующей инкубацией с раствором трипсина (0,25%-ный неочищенный или 0,01- 0,025%-ный очищенный) в течение 15 мин.

После этого трипсин удаляется, клетки суспендируют в среде, определяют их количество и рассевают в новые флаконы.  

Замена питательной среды.

Как определить, что клеточную культуру пора рассевать?

• клетки образуют плотный монослой;

• индикатор-краситель меняет цвет (например, индикаторный краситель Phenol Red (феноловый красный)меняет цвет с ярко-красного в свежей среде до желто-оранжевого в среде с культивируемыми в течение некоторого времени клетками)

Некоторые быстроделящиеся клетки требуют смены среды после 3 - 4 суток культивирования. Однако клетки можно приучить к более длительному культивированию без замены среды или пересева. Для этого можно уменьшить содержание в среде сыворотки (до 4 - 5%) или рассевать клетки в соотношении 1/5 - 1/6, но не ниже допустимого предела концентрации. Для фибробластов, например, такая критическая концентрация равняется приблизительно 300-350 тыс. клеток/мл

46) что такое устойчивая клеточная линия

Устойчивые (стабильные) клеточные линии (established cell lines) [лат. stabilis— устойчивый; лат. linea — расположение чего-либо в один ряд] — культуры клеток, способные к неограниченному ростуin vitro. Получаются из перевиваемых клеточных культур, часть клеток которых приобретает селективные преимущества и обладает повышенной скоростью роста

In vitro(лат.«в стекле») — это технология выполненияэкспериментов, когда опыты проводятся «впробирке» — вне живогоорганизма. В общем смысле этот термин противопоставляется терминуin vivo— эксперимент на живом организме (на человеке или на животной модели). Многие эксперименты, имеющие отношение кмолекулярной биологии,биохимии,фармакологии,медицине,генетикеи др., проводятся вне организма, на культуре живыхклетокили в бесклеточной модели.

Эксперименты in vitro, в тех случаях, когда альтернативой являются исследования на животных или человеке, считаются менее достоверными, чемin vivo^[1]и часто бывают лишь необходимой предварительной стадией для оценки возможности и необходимости последующих исследованийin vivo^[2]. Однако они часто удешевляют предварительные стадии исследования и позволяют сохранить жизнь подопытных животных.