Суправитальный метод окраски ретикулоцитов.

Принцип:

Выявление зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при окраске бриллиант-крезиловым синим без предварительной фиксации.

Реактивы:

1 % раствор бриллиант-крезилового синего: 50 мг краски растворяют в 5 мл физиологического раствора и добавляют 20 мг цитрата натрия (раствор хранят в посуде из темного стекла, годен в течение нескольких дней).

Методика:

На предметное стекло с лункой наносят 2 капли 1 % раствора краски бриллиантового крезилового синего и 1 каплю крови. Осторожно перемешивают стеклянной палочкой и смесь помещают во влажную камеру (чашку Петри, в которую по краям вкладывают слегка смоченные валики марли или ваты) на 30 минут при комнатной температуре. Затем делают мазки и высушивают.

Подсчет ретикулоцитов:

В мазках эритроциты окрашиваются в желтовато-зеленый цвет, а зернисто-сетчатая субстанция в ретикулоцитах - в синий и фиолетовый цвет.

Мазки микроскопируют с иммерсионным объективом. Подсчет ретикулоцитов производят на 1000 эритроцитов (большая точность получается при подсчете 2000-3000 эритроцитов).

Увеличение числа ретикулоцитов наблюдается при:

• стимуляции эритропоэза (кровопотеря, гемолиз, ретикулоцитарный криз при успешном лечении В₁₂-дефицитной анемии, острый недостаток кислорода).

Уменьшение числа ретикулоцитов наблюдается при:

• угнетении эритропоэза (апластические и гипопластические анемии, нелеченные В₁₂-дефицитные анемии, метастазы рака в кости),

• заболеваниях почек, эндокринных заболеваниях.

Увеличение ретикулоцитов их в периферической крови (ретикулоцитоз) отмечается: • при гемолитических анемиях (число ретикулоцитов может доходить до 60% и более (особенно сильно увеличиваясь при гемолитических кризах); • при острых кровопотерях (на 3 – 5 сутки после кровопотери возникает ретикулоцитарный криз), в том числе, увеличение ретикулоцитов позволяет заподозрить скрытое кровотечение (например, у больных язвенной болезнью желудочно-кишечного тракта, брюшным тифом); • при малярии;  • при полицитемии;  • при лечении железом железодефицитных анемий (через несколько дней (3 - 10) после начала антианемического лечения пернициозной анемии);  • при остром недостатке кислорода; • при метастазах опухолей в костный мозг. Следует помнить, что в случае усиленного разрушения эритроцитов доля ретикулоцитов может превышать 50% вследствие искусственного завышения числа ретикулоцитов (как уже было отмечено ранее, доля ретикулоцитов рассчитывается в % от всех эритроцитов). В таких случаях ля оценки тяжести анемий используют «ретикулярный индекс», который рассчитывают по формуле: (% ретикулоцитов х гематокрит) / 45 х 1,85, где 45 – нормальный гематокрит, 1,85- количество суток, необходимых для поступления новых ретикулоцитов в кровь. Если индекс < 2 – говорит о гипопролиферативном компоненте анемии, если > 2-3, то происходит увеличение образования эритроцитов. Истинный ретикулоцитоз: увеличение количества ретикулоцитов в периферической крови с одновременным увеличением количества ретикулоцитов в костном мозге.  Ложный ретикулоцитоз: отсутствие повышенного количества ретикулоцитов в костном мозге при повышении их количества в периферической крови (что говорит об усилении вымывания ретикулоцитов из костного мозга в периферическую кровь). Фактором, приводящим к увеличению значения %-ого содержания ретикулоцитов могут быть прием следующих препаратов: кортикотропин, противомалярийные лекарственные средства, жаропонижающие препараты, фуразолидона (у маленьких детей), леводопы.  Запомните: ретикулоцитоз, без соответствующей эритронормобластической реакции костного мозга, наблюдается при раздражении отдельных участков его раковыми метастазами или воспалительными очагами. Возможной ошибкой при подсчете ретикулоцитов может быть их ложное завышение из-за наличия:  • включений в эритроцитах (тельца Жолли, малярийные паразиты);  • высокого лейкоцитоза; • аномальной формы гемоглобина; • гипертромбоцитоза; • гигантских тромбоцитов. Снижение количества или отсутствие ретикулоцитов (ретикулоцитопения) наблюдается: • при арегенераторных апластических и гипопластических анемиях;  • при анемиях, вызванных недостаточностью содержания железа, витамина B12, фолиевой кислоты (микроцитарно-гипохромные и мегалобластные анемии);  • при талассемии;  • при сидеробластной анемии;  • при метастазах рака в кость;  • при лучевой болезни и лучевой терапии;  • при лечении цитостатиками; • при аутоиммунных заболеваниях системы кроветворения;  • при заболеваниях почек;  • при алкоголизме;  • при рецидиве анемии Аддисона-Бирмера; • при микседеме. Факторы, искажающие результат лабораторного исследования %-ого содержания ретикулоцитов: • неправильный выбор антикоагулянта или недостаточное перемешивание крови с антикоагулянтом; • длительное сдавливание руки жгутом;  • прием сульфаниламидов (возможны как заниженные, так и завышенные результаты);  • переливание крови незадолго до исследования; • гемолиз пробы крови.  Показания к назначению анализа на ретикулоциты:  • оценка активности эритропоэза при состояниях, сопровождающихся гемолизом или кровопотерей; • ценка способности костного мозга к регенерации после цитотоксической терапии и трансплантации костного мозга; • ценка восстановления синтеза эритропоэтина после трансплантации почки; • допинговый контроль у спортсменов (прием эритропоэтина); • диагностика неэффективного гемопоэза или снижения продукции эритроцитов; • дифференциальная диагностика анемий; • детекция нарушения регенераторной способности костного мозга при дефиците железа, витаминов B12, B6, фолатов, меди и мониторинга соответствующей терапии; • оценка реакции на терапию эритропоэтином, эритросупрессорами.

МЕТОДЫ ПОДСЧЕТА КОЛИЧЕСТВА РЕТИКУЛОЦИТОВ

(1) Подсчет количества ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями.  Данный метод является на практике наиболее используемым методом в связи с тем, что он простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, соответственно может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории. Принцип метода основан на выявлении зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками (насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте / раствор азура I /раствор азура II) с дальнейшим подсчетом их в мазке крови. Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке.  Подсчет осуществляют с помощью микроскопа: приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом; в мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I). (2) Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии.  Данный метод отличается простотой и требует немного времени, более точен по сравнению с обычным методом, так как при люминесцентной микроскопии обнаруживаются мельчайшие зерна сетчато-нитчатого вещества, однако он возможен только при наличии люминесцентного микроскопа и специальных красителей, в связи с чем доступен лишь немногим лабораториям. Принцип подсчета количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии основан на использовании способности субстанции ретикулоцитов флюоресцировать после обработки крови акридиновым оранжевым. Кровь смешивают с акридиновым оранжевым в пробирке или смесителе в соотношении 1 часть крови и 10 частей краски (смесь можно хранить не более 5 часов). Смесь перемешивают в течение 2 минут, каплю смеси наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. При этом жидкость не должна выходить за пределы покровного стекла.  Микроскопируют с помощью светофильтра ЖС-17. В препарате эритроциты имеют темно-зеленые очертания и не флюоресцируют, а в ретикулоцитах зернисто-сетчатая субстанция светится ярко-красным цветом, благодаря чему ретикулоциты легко подсчитать. В крови, стабилизированной гепарином или цитратом натрия, флюоресценции ретикулоцитов не наблюдается. (3) Автоматический подсчет количества ретикулоцитов с помощью гематологического анализатора. В современных гематологических анализаторах технология подсчета форменных элементов крови основана на кондуктометрическом методе, предложенном H. Wallace и Joseph R. Culter в 1947 г. Принцип метода заключается в подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клетки через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Каждое прохождение клетки через апертуру сопровождается появлением электрического импульса, который регистрируется электронным датчиком. Разделение клеток по категориям (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, осадок) осуществляется прибором на основании анализа амплитуды полученных импульсов.Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать количество импульсов, которые при этом генерируются.  Следует обратить внимание на то, что помимо классического параметра ретикулоцитов - относительное (%) содержание ретикулоцитов (RET%, percent of reticulocytes), определяемого с помощью 1 и 2 методов лабораторной диагностики, в связи с появлением высокотехнологичных гематологических анализаторов (3 метод) стало возможным получать (например, с помощью запатентованного флюоресцентного красителя для анализатора Sysmex -XT- 2000i) дополнительные информативные ретикулоцитарные параметры: • ретикулоциты с низким содержанием РНК, наиболее зрелые (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов с низкой флуоресценцией); • ретикулоциты со средним содержанием РНК (MFR%, medium fluorescence reticulocyte fractions) - фракция ретикулоцитов со средней флуоресценцией); • ретикулоциты с высоким содержанием РНК (HFR%, high fluorescence reticulocyte fractions) - фракция ретикулоцитов с высокой флуоресценцией); • незрелая фракция ретикулоцитов (IRF%, Immature Reticulocyte Fraction). Дифференцировка ретикулоцитов, основанная на степени зрелости и, соответственно, содержании нуклеиновых кислот, является отражением гемопоэтической активности костного мозга. Методика (анализатор Sysmex -XT- 2000i). В проточной кювете клетки пересекают луч полупроводникового лазера, при этом происходит рассеивание луча под большим и малым углами и возбуждение флюоресцентного красителя. Это позволяет определять различные стадии зрелости ретикулоцитов по содержанию РНК в клетках и интенсивности их свечения. Автоматизированный подсчет ретикулоцитов отличается высокой точностью (подсчитывается более 30 000 эритроцитов) и воспроизводимостью (коэффициент вариации составляет около 6%). Данная технология обеспечивает точный подсчет ретикулоцитов даже при их предельно низких концентрациях. 

14. Ретикулоцитопении и ретикулоцитозы, причины развития, диагностическое значение их выявления.