1. Регуляция биосинтеза белка

Для прокариот: роль 6-субъединицы рнк-полимеразы, ффГфф, механизмы индукции и репрессии (на примере лак-оперона и триптофанового оперона), роль цАмф (катаболическая репрессия) в регуляции.

В живых организмах происходит избирательный синтез белков, различные белки образуются с неодинаковой скоростью (у Е. coli – 10 молекул на клетку, у др. – до 500 тыс.). Соматические клетки всех тканей и органов многоклеточного организма имеют одинаковую генетическую информацию, но отличаются друг от друга по содержанию тех или иных белков (эритроциты - гемоглобин, кожа – коллаген, клетки поджелудочной железы вырабатывают много – ферментативные белки). В отдельных клетках, тканях и органах содержание разных белков меняется с возрастом, с фазой развития => в живых организмах существуют механизмы регуляции скорости белкового синтеза. Они функционируют под действием внутренних и внешних факторов на каждой из стадий сложного процесса синтеза белка. Количество белка может изменяться в результате специфического увеличения числа некоторых генов, регуляции на стадии транскрипции, процессинга мРНК. Скорость белкового синтеза определяется и временем жизни мРНК, регуляцией синтеза на уровне трансляции, посттрансляционной модификации белков. 

У прокариотических организмов механизмы регуляции белкового синтеза + регуляция синтеза индуцибельных ферментов у бактерий, т. е. таких ферментов, количество которых резко возрастает при добавлении в питательную среду субстрата этих ферментов/индуктора, наиболее хорошо изучены на стадии транскрипции.

Например, у Е. coli усиленный синтез ферментов метаболизма лактозы происходит только на среде с лактозой, когда она является единственным источником углерода и энергии. В ее отсутствие содержание этих ферментов в клетках очень мало. Индукция их синтеза у Е. coli исследована Ф. Жакобом и Ж. Моно. Синтез этих ферментов происходит на лактозном опероне (lac-оперон).

Лактозный оперон Е. coli объединяет три структурных цистрона, кодирующих три фермента: галактозидпермеазу (участвует в переносе лактозы через мембрану внутрь клетки), β-галактозидазу (осуществляет расщепление лактозы на глюкозу и галактозу) и тиогалактозид-ацетилтрансферазу (роль исследована недостаточно).

Один из видов контроля синтеза (индуцибельных) ферментов Lас-оперона на генетическом уровне осуществляется при участии регуляторного белка-репрессора, структура которого закодирована в гене-регуляторе (рис), не входящем в состав оперона. В отсутствие лактозы lас-оперон не транскрибируется, так как оператор блокирован за счет присоединения к нему репрессора, препятствующего специфическому присоединению РНК-полимеразы к промотору и продвижению РНК-полимеразы по ДНК. В связи с этим структурные цистроны lac-оперона и других оперонов, находящиеся под контролем одной и той же регуляторной зоны, включаются в трансляцию и выключаются одновременно.

Репрессор lac-оперона находится в связанном с ДНК состоянии, пока не вступит во взаимодействие с индуктором – лактозой. Лактоза связывается с белком-репрессором, меняет его конформацию, в результате чего он становится неспособным присоединяться к оператору. При таком состоянии оператора происходят транскрипция, трансляция, синтез ферментов катаболизма лактозы. При участии репрессора, образующегося изначально в активной, т. е. способной связываться с оператором, форме, и индуктора, переводящего репрессор в неактивную форму, происходит регуляция синтеза индуцибельных ферментов.

Известны также репрессируемые ферменты, их образование подавляется продуктом катализируемой ими реакции. Действие этих оперонов также контролируется с участием белков-репрессоров, но они синтезируются изначально в неактивной форме. Присоединение к ним накопившегося в значительном количестве продукта ферментативной реакции – корепрессора (например, триптофана, в случае триптофанового оперона) переводит их в активную форму, что сопровождается связыванием активированных репрессоров с оператором и прекращением синтеза белка (рис).

Таким образом, индукция и репрессия синтеза ферментов по своему механизму сходны. Отличие заключается в природе репрессора: у индуцибельных ферментов свободный репрессор активен, а у репрессируемых – неактивен и активируется в присутствии корепрессора.

В большинстве исследованных случаев индуцибельными являются опероны, ответственные за синтез ферментов, катализирующих катаболические реакции (сбраживание сахаров, распад аминокислот и др.) Индукторами таких оперонов, переводящими активный репрессор в неактивную форму, являются субстраты этих катаболических ферментов. Репрессируемые опероны, как правило, – системы синтеза анаболических ферментов, катализирующих реакции синтеза аминокислот, азотистых оснований и т. д. В качестве корепрессора, активирующего репрессор, выступают продукты, синтезируемые ферментами данного оперона.

Если ген-регулятор располагается перед группой оперонов, кодирующих ферменты, ответственные за разные промежуточные реакции синтеза одного и того же соединения, то он контролирует работу всех оперонов с участием единственного репрессора.

Существуют также конститутивные белки и в том числе конститутивные ферменты – белки и ферменты, количество кот. несущественно изменяется в процессе жизнедеятельности организма. Они постоянно синтезируются клеткой, на скорость их синтеза существенно не влияет состав среды. Например, ферменты, участвующие в расщеплении глюкозы у Е. coli. Уровень конститутивного синтеза зависит от скорости синтеза мРНК, скорости прикрепления к ней рибосом, считывания матрицы и времени жизни мРНК. Оперон, отвечающий за синтез конститутивного белка, не содержит активно действующего оператора. Потеря активности оператором может произойти в принципе у любого оперона вследствие мутации. В таком случае действие репрессоров блокируется и идет неконтролируемый синтез белков.

Регуляция синтеза ферментов lac-оперона Е. coli на стадии транскрипции может происходить и при участии механизма катаболитной репрессии, осуществляющейся под действием цАМФ. Катаболитную репрессию индуцибельных ферментов через цАМФ вызывают субстраты конститутивных ферментов. Е. coli не утилизирует лактозу и не синтезирует соответствующие ферменты в присутствии более доступного энергетического субстрата – глюкозы, которая используется организмами при участии конститутивных ферментов. Объясняется это тем, что один из продуктов расщепления глюкозы/катаболит снижает внутриклеточный уровень цАМФ. В отсутствие глюкозы содержание цАМФ в клетке существенно повышается, она связывается со специфическим белком клетки – БРЦ (белок-рецептор цАМФ) или CRP (от cAMP receptor protein). Комплекс цАМФ-БРЦ способен взаимодействовать с промотором lac-оперона, изменять пространственную структуру данного участка ДНК таким образом, что становится возможным присоединение к нему РНК-полимеразы. Это увеличивает скорость транскрипции оперона (рис). Следовательно, транскрипция lac-оперона находится и под позитивным (с участием комплекса цАМФ-БРЦ) и негативным (через репрессор) контролем. При негативном контроле lac-оперон транскрибируется в отсутствие регуляторного белка-репрессора, в случае позитивного контроля для «запуска» оперона необходим регуляторный белок – комплекс цАМФ-БРЦ.

В настоящее время установлено, что роль цАМФ в регуляции активности генома заключается не только в инициации транскрипции, но и в противодействии терминации транскрипции.

?В обеспечении селективности транскрипции, т. е. выборе транскрибируемого оперона, существенную роль играет β’-субъединица РНК-полимеразы. Она сама не обладает сродством к ДНК, но уменьшает неспецифическое присоединение РНК-полимеразы к ДНК. Установлено, что β'-субъединица – единственный компонент РНК-полимеразы, имеющей сродство к ДНК.

?Широкое распространение получила гипотеза сменных β'-субъ-единиц, которые бы придавали РНК-полимеразе сродство к разным промоторам, направляя ее на транскрипцию разных участков генома. Однако «выбор» промоторов этот фермент может осуществлять и без β'-субъединицы, при условии присоединения к нему некоторых других дополнительных полипептидов.

?В опытах с Е. coli обнаружено, что изменение транскрипционной специфичности РНК-полимеразы зависит также от АДФ-рибозилирования β'-субъединицы. Следовательно, функция последней также связана со специфичностью транскрипции отдельных участков генома. Таким образом, механизмы изменения специфичности РНК-полимеразы разнообразны и не сводятся к смене серии β'-субъединиц.

?Скорость синтеза белков у прокариот зависит также от матричной активности ДНК, которая изменяется при химической модификации ДНК, в частности метилировании с участием ДНК-метилаз, а также от особенностей сверхспирализации ДНК, определяемой соотношением типов ДНК-топоизомераз (ДНК-гиразы и ДНК-релаксазы).

Для прокариот установлен еще один очень своеобразный механизм контроля белкового синтеза. При недостатке аминокислот в клетках накапливаются значительные количества необычного нуклеотида — гуанозинтетрафосфата (ффГфф), который прерывает инициацию синтеза рРНК и тРНК, присоединяясь к РНК-полимеразе. ффГфф образуется при участии специфического фермента в том случае, если ненагруженная аминокислотой молекула тРНК связывается с А-участком на рибосоме. Это инициирует реакцию отщепления пирофосфатной группы от АТФ и перенос ее на фф⁵Г³ОН (ГДФ), что и приводит к синтезу необычного нуклеотида. Ряд генов может находиться и под позитивным контролем ффГфф. Таким путем контролируются системы, способные восстанавливать белковый синтез, подавленный в результате недостатка аминокислот.

Для ряда оперонов биосинтеза аминокислот (например, триптофана) показано существование механизма регуляции с участием специфического регуляторного участка ДНК – аттенюатора, расположенного непосредственно перед структурными цистронами, после оператора. Аттенюатор, включающий около 30 нуклеотидов, может выполнять роль терминатора синтеза мРНК. При обычных колебаниях содержания триптофана в среде большинство начавших синтезироваться мРНК терминируется в области аттенюатора, образуя небольшую по размерам лидерную РНК. Малая часть инициированных мРНК (до 10%) транскрибируется до конца. При голодании по триптофану доля терминации в аттенюаторе снижается.

Существуют и механизмы контроля скорости белкового синтеза на уровне трансляции. Фактором ограничения скорости или даже прекращения трансляции может быть недостаточное количество тРНК определенных видов или даже полное отсутствие их. Так, после заражения Е. coli каким-либо фагом одни тРНК исчезают, новые появляются. В результате некоторые белки совсем перестают синтезироваться. Предполагают, что фаг путем модифицирования (метилирование, тиолирование) ингибирует одни тРНК, а другие активирует. Недостаток тРНК какого-либо типа может быть результатом действия на них нуклеаз с расщеплением ЦЦА-конца. Скорость трансляции может регулироваться также вследствие изменения активности аминоацил-тРНК-синтетаз (это, например, могут вызывать фаги своими белками), а также числа и активности рибосом, в частности активности пептидилтрансферазы.

Роль σ-субъединицы. Присоединение РНК-полимеразы к промотору можно ускорить не только с помощью изменений промоторной области ДНК, но и воздействуя на структуру самой РНК-полимеразы. Например, набор тех генов, к промоторам которых будет присоединяться РНК-полимераза, определяется с помощью σ-субьединицы (сигма-субъединицы) этого фермента. Сигма-субъединица “позволяет” или “не позволяет” РНК-полимеразе “прилипнуть” к нужному промотору. Если присоединения к промотору не произошло, то белок с гена, контролируемого данным промотором, синтезироваться не будет.

Транскрипцию практически всех жизненно важных генов, обеспечивающих гомеостатические клеточные процессы (репликацию ДНК, транскрипцию, трансляцию и т.д.), обеспечивают σ-субъединицы, называемые основными. Остальные процессы требуют альтернативных σ-субъединиц. которых в настоящее время описано не менее десяти. Например, у Е. coli при резком повышении температуры (тепловом шоке) начинает синтезироваться альтернативная субъединица а³² (с молекулярной массой 32 кДа). Ее присутствие придает РНК-полимеразе способность находить промоторы генов, кодирующие защитные белки - БТШ (белки теплового шока).