Аудиторная работа.

Лабораторная работа (активаторы и ингибиторы ферментативных реакций)

1. Выявление ускоряющего и замедляющего влияния на ферменты.

Хлорид натрия - активатор амилазы слюны, ингибиторы амилазы ионы серебра, соли меди, свинца.

Ход работы. В три пробирки внести по 3 мл слюны, разведенной 1:3 водой. В первую пробирку добавить 2 капли 1%-ного раствора хлорида натрия, во вторую - 1 каплю 1%-ного раствора сернокислой меди, в третью - каплю воды (контроль). Затем во все пробирки внести по 5 капель 1%-го раствора крахмала и оставить при 370С на 3 мин, после чего внести во все пробирки по одной капле раствора Люголя и сравнить интенсивность появляющегося синего окрашивания, характерного для крахмала. Выявить (по интенсивности окраски), в какой из пробирок произошел наиболее полный распад крахмала. Напомним, что интенсивность окра-

ски пропорциональна концентрации крахмала.

2. Количественное определение активности амилазы мочи (диа-

стазы). Нормальная активность диастазы в моче здоровых людей невелика - от 4 до 64 ед. (за единицу принимают то её количество, которое за 30 мин при 380С полностью расщепляет 1 мл 0,1%-ного раствора крахмала).

При некротических процессах или воспалительных заболеваниях поджелудочной железы, при воспалении околоушной железы увеличивается активность диастазы в крови, и, как следствие, в моче. Это наблюдение является вспомогательным диагностическим признаком.

Ход работы. В десять пронумерованных пробирок внести по 1 мл 0,14 н раствора хлорида натрия. В одну из пробирок внести 1 мл исследуемой мочи, смешать и затем перенести 1 мл смеси во вторую пробирку, смешать, перенести в третью и т. д. Из последней (десятой) пробирки 1 мл смеси вылить. Во все пробирки внести по 2 мл 0,1%-ного раствора крахмала и по 1 мл 0,14 н раствора хлорида натрия, смешать, поместить на водяную баню (450С) на 15 мин.

Одновременно и быстро охладить все пробирки, поместив их в холодную воду и добавить в каждую по одной капле раствора Люголя. Жидкость окрашивается в желтоватый цвет йодом, в различные оттенки розового (декстрины) и фиолетового (декстрины с большим размером молекул), а также в синий цвет (крахмал).

Учет результата. Рассчитать количество мочи в последней (слева направо) пробирке, сохранившей желтоватую окраску (полное расщепление крахмала).

Допустим, это пробирка № 4, моча в которой разведена в 16 раз по сравнению с пробиркой 1, где было 0,5 мл мочи. Следовательно, в пробирке 4-й мочи содержится 0,03125 мл (0,5/16). Это количество мочи вызвало расщепление 2 мл 0,1%-го раствора крахмала, а 1 мл мочи способен

22

расщепить х мл, т.е. 0,03125 мл мочи расщепило 2 мл 0,1%-ного раствора

крахмала, а 1,0 мочи может расщепить хмл крахмала. Составляем уравнение и рассчитаем значение величины Х:

следовательно, в моче содержится 64 ед. амилазы на 1 мл мочи

3адание: каждый студент получает результаты анализа двух проб мочи и определяет содержание диастазы в одном мл мочи, выражая в единицах. Результат сопоставить с нормальными значениями.

Выполнить следующее:

1.При определении активности фермента получены данные, представленные в таблице:

Построить график зависимости активности энзима от рН, высказать предположение о том, какой фермент находится в растворе, определить принадлежность фермента к классу и группе соответственно высказанному предположению.

2.Оптимум рН исследуемого фермента 6,9 - 7,0, субстрат фермента - высокомолекулярный природный полимер, обнаруживаемый по характерному окрашиванию в присутствии йода; продукты взаимодействия фермента с субстратом окрашиваются при нагревании в присутствии сернокислой меди в красно-кирпичный цвет.

Назовите фермент, субстрат, реагент, используемый для обнаружения субстрата, продукты гидролиза субстрата и определите принадлежность фермента к классу, группе.

3.Субстрат исследуемого фермента образует белый осадок при нагревании, дает положительную биуретовую реакцию. После длительной инкубации с ферментом при разных значениях рН интенсивность биуретовой реакции снизилась, увеличилось число свободных аминогрупп, усилилась положительная реакция с нингидрином. Особенно заметными эти изменения были при рН 8,0 - 9,0.

Назовите субстрат, фермент, определите принадлежность фермента к классу и группе. Почему увеличилось число свободных аминогрупп и нингидриновая реакция: стала интенсивнее?

4.За единицу активности амилазы слюны принимают то ее количество, которое расщепляет за 30 мин при 380С 1 мл 0,1%-ного раствора крахмала. При инкубации разведенной слюны обнаружилось, что в восьмой

23

пробирке реактив Люголя окрашивает жидкость в желтый цвет, а в девятой появился розовый оттенок. Разведение слюны готовили в геометрической прогрессии со знаменателем, равным двум (в пробирке 1 был 1 мл слюны). Количество раствора крахмала везде было одинаковым - 1 мл. Сколько единиц активности амилазы содержит 1 мл исследуемой слюны?

5.Исследуемый фермент расщепляет внутримолекулярные связи (исключая связи С-С) согласно реакции А + Б +Н2О> АН+БОН.

К какому классу относится фермент?

6.Фермент расщепляет С - С связи негидролитическим путем. Назовите класс, к которому относится фермент.

8.К какому классу относится фермент, катализирующий превращение молекулы глюкозы в молекулу фруктозы?

9.Назовите класс, к которому относится фермент, катализирующий реакции типа СН3 - СО - СООН + CО2 → HООC - СН2 – СО - СООН.

ЗАНЯТИЕ 7 (Введение в обмен веществ и энергии. Биологическое окисление).

Цель: 1. Познакомиться с определением понятия «Обмен веществ», убедиться в том, что обмен веществ – совокупность всех химических превращений в организме; познакомиться с терминологией, используемой при изучении настоящего раздела, уяснить суть понятий «анаболизм» и «катаболизм» и их отличия от терминов синтез и распад. 2. Познакомиться с историей развития представлений о биологическом окислении и современным понятием «биологическое окисление», с представлением о формах биологического окисления, роли свободных радикалов кислорода, значении свободнорадикального окисления.

Студент должен знать:

1.Что включает понятие «Обмен веществ».

2.Как сочетаются в обменных процессах (анаболических и катаболических) реакции синтеза и распада.

3.Что значит «метаболический путь», виды метаболических путей.

4.Чем отличается биологическое окисление от окисления в неживой природе.

5.В чем заключается биологический смысл окисления в организмах.

6.Структуру макроэргических соединений.

7.Что представляет собой свободнорадикальное окисление.

24

.Студент должен уметь:

1. Отличать понятия катаболизм и анаболизм от понятий синтез и де-

струкция (расщепление).

2.Охарактеризовать основные этапы метаболизма

3.Составить схему круговорота энергии и веществ в живой природе с учетом аутотрофных и гетеротрофных организмов.

4.Изобразить структурные формулы важнейших макроэргических соединений живой природы.

5.Составить схему экспериментального выявления окислительно-вос- становительных свойств у исследуемого вещества (на примере тирозина)

Студент должен получить представление:

1)об общих чертах метаболических процессов,

2)о важнейших источниках энергии в животном организме,

3)о значении свободнорадикального окисления как физиологического процесса,

4)о патологических состояниях, связанных с гипероксидацией,

5)о значении антиоксидантов в комплексе терапевтических мероприятий.

Сведения из базовых дисциплин, необходимые для изучения темы:

1)основные положения термодинамики,

2)понятия о фазовых реакциях,

3)сведения о катализе,

5)сведения о процессах фотосинтеза в клетке,

6)современная номенклатура химических соединений.

Аудиторная работа.

Лабораторная работа (Оксидоредуктазы)

Обнаружение тирозиназы в картофеле. Фермент тирозиназа (или со-

гласно классификации моноамин: О2-оксидоредуктаза дезаминирующая)

содержится в тканях растений и животных, относится к числу медьсодержащих белков, катализирует, как следует из рационального названия, окислительное дезаминирование моноаминов согласно реакции:

25

О2+Моноамин + Н2О→Альдегид +Аммиак + Н2О2.

Ворганизме тирозиназа катализирует превращение адреналина в адренохром - бурый пигмент.

Ход работы. Примерно 1 г картофеля измельчить скальпелем и растереть

вступке с 3 мл дистиллированной воды. Гомогенат фильтровать через двойной слой марли - в фильтрате содержится тирозиназа.

Вдве пробирки внести по 1 мл фильтрата. Содержимое одной пробирки нагреть до кипения и поддерживать кипение 2 мин (инактивация

фермента). В обе пробирки внести по 5 капель 0,1%-ного раствора адреналина, смешать и инкубировать при 400С, периодически встряхивая и наблюдая за изменением окраски.

Жидкость в пробирке с активным (не подвергшимся нагреванию) фильтратом розовеет, затем принимает бурую и темную окраску. Это связано с окислительным дезаминированием, приводящим к образованию пигментов. В пробирке, где фермент инактивирован кипячением, изменение окраски не наблюдается, т. е. адреналин не подвергается превращениям.

Аргументировано и кратко ответить на следующее:

1.Может ли осуществиться окисление СНЗ - СН2 - СН2 - ОН в СН3 - СН2-СН=О в бескислородной среде? Какие условия для этого необходимы? Написать схему реакции.

2.Может ли и при каком условии в бескислородной среде произойти

окисление по типу СН3 - СН2 - СН=О → СН3 - СН2 - СООН? Укажите необходимые компоненты, составьте схему реакции.

3.Является ли кислород исключительным (единственным) конечным акцептором водорода в цепи тканевого дыхания и вообще в биологическом окислении? Почему эволюция «избрала» кислород в качестве конечного акцептора водорода?

4.Реакция СН3 - СН =О → СН3 - СООН осуществлена в бескислородной среде. Как объяснить появление двух атомов кислорода в продукте реакции, в то время как исходный продукт содержит только один атом кислорода?

5.Какие компоненты, необходимые для осуществления изображенной ниже реакции, отсутствуют в схеме?

СООН - СН2-- СН2 – СООН + 1/2О2 → СООН - СН = СН - СООН+Н2О.

5. Почему окисление в живой природе отождествляли с горением ?

26

6.Описать внешние признаки сходства между горением и процессом окисления в организме.

7.Где в организме осуществляется потребление кислорода ?

8.Назвать предпосылки, обусловившие появление теории активации водорода.

9.Сформулировать понятие «дегидрирование», определить роль кислорода и воды в биологическом окислении, протекающем как процесс дегидрирования.

10.Функция кислорода в дегидрировании (определить с помощью трёх слов).

11.Сформулировать современное положение о биологическом окислении, назвать его виды.

12.Свободнорадикальное окисление в клетке, активные формы кислорода, как ограничивается интенсивность процесса.

ЗАНЯТИЕ 8 («Тканевое дыхание, локализация и участники процесса»)

Цель: ознакомиться с важнейшим механизмом биологического окисления – тканевым дыханием, структурой и локализацией ферментов этого процесса, с механизмами транспорта протонов и электронов по дыхательной цепи, фактором, определяющим направление переноса.

Студент должен знать:

1.В какой роли выступает в процессе тканевого дыхания окисляемый субстрат.

2.Что представляют собой акцепторы-донаторы протонов и электронов в дыхательной цепи, их структуру, последовательность взаимодействия,

3.Чем определяется направление транспорта протонов-электронов; компоненты структуры простетических групп дегидрогеназ, определяющие их способность транспортировать электроны и протоны.

4.Водородтранспортный и электронтранспортный участки дыхательной цепи, множественность форм электронтранспортных компонентов, чем отличаются неаутооксидабельные и аутооксидабельные компоненты.

5.Локализацию энзимов тканевого дыхания, последовательность их расположения во внутренней мембране митохондрии.

27

6.О свойстве внутренней мембраны относительно Н-ионов, структуру и роль протонного канала.

7.Значение некоторых витаминов в транспорте протонов и электронов.

8.Отличия в механизмах дегидрирования насыщенных, ненасыщенных соединений, спиртов, альдегидов, кетонов и аминокислот.

.Студент должен уметь:

1.о ведущей роли биологического окисления в поддержании энергетического обмена,

2.Опознать по структуре кофермента дегидрогеназ их место в дыхательной цепи.

3.Составить схему локализации и функционирования дыхательной цепи.

4.Изобразить схему того структурного компонента митохондрий, в котором располагаются энзимы дыхательной цепи, указать на схеме элементы протонного канала

5.Уметь изображать структурные формулы важнейших макроэргических соединений живой природы.

6.Показать на фрагментах структурных формул насыщенных и ненасыщенных соединений, спиртов, альдегидов и кетонов ход их дегидрирования.

Студент должен получить представление:

1) о значении нарушений биологического окисления в развитии некоторых патологических состояний,

3) о патологических состояниях, ведущих к нарушению энергетического обмена..

Сведения из базовых дисциплин, необходимые для изучения темы:

1)основные положения термодинамики,

2)представления об окислительно-восстановительном потенциале,

3)о принципах определения окислительно-восстановительного потенциа-

ла in vitro.

Аудиторная работа.

28

Лабораторная работа (сопоставление окислительно-восстанови- тельного потенциала рибофлавина и метиленовой сини).

Ход работы. В пробирку внести 4 - 5 капель воды, одну каплю взвеси рибофлавина и по каплям добавлять раствор красителя «метиленовый синий» до появления синего или зеленовато-синего окрашивания раствора. Затем внести в пробирку гранулу цинка и 2 капли концентрированной соляной кислоты. Начинается выделение пузырьков водорода. По мере насыщения раствора водородом окислительно-восстановительный потенциал смеси постепенно снижается, и происходит восстановление рибофлавина и метиленового синего. Восстановление всего имеющегося метиленового синего (Е - 0,11) происходит раньше, чем восстановление значительной части рибофлавина (Е - 0,20), поэтому окраска жидкости переходит последовательно в зеленый, желто-зеленый, желтый и, наконец, блед- но-желтый или розовый цвет.

Бледно-желтую жидкость слить в другую пробирку и наблюдать изменение окраски. Водород в жидкость больше не поступает, а ранее растворенный в ней водород частично уходит в атмосферный воздух, отчасти переносится через рибофлавин и метиленовый синий на кислород воздуха. В связи с этим окислительно-восстановительный потенциал, постепенно повышается. После расходования водорода в растворе начинается окисление восстановленного рибофлавина, он передает водород через метиленовый синий на кислород и приобретает желтую окраску (раствор желтеет). Затем начинается окисление восстановленного (т.е. бесцветного) метиленового синего - раствор становится вначале зеленым, а затем синим.

В протоколе работы записать схему переноса водорода в изучаемой системе.

Дать (приводя ход решения) ответы на следующие задачи или выполнить указанные действия:

1. Соединения А, В, С, Х и Y имеют редокс-потенциалы, равные - 0,39, + 0,22, - 0,37, - 0,35, + 0,28 В соответственно.

В какой последовательности будет происходить перенос электронов в системе, включающей эти соединения (от водородного электрода)?

2. Написать реакции дегидрирования соединений:

а) R-СН2-СН2-R; б) R-СН=О; в) R-СНОН-R; г) R-СН=СН-R.

3.Какие из перечисленных соединений являются субстратом флавиновых

ферментов: глюкоза, сахароза, янтарная кислота, глицериновый альдегид, НАД Н+, НАДФ Н+, глутаминовая кислота?

4.Какие из перечисленных соединений могут служить акцепторами водо-

рода от флавиновых ферментов: О2, НАД, НАДФ, цитохромы, пирови-

ноградная кислота, глутатион, фумаровая кислота?

29

5.Как изменится коэффициент полезного действия (КПД) тканевого дыхания, сопряженного с окислительным фосфорилированием, если в переносе протонов и электронов не участвуют НАД-дегидрогеназы (КПД в условия нормы принять равным 0,4)?

6.Как изменится теплопродукция органа; если при постоянной интенсивности тканевого дыхания в связи с появлением разобщающего фактора коэффициент Р/О снизился с 3 до 1?

7.Какой элемент отсутствует в уравнении:

СOOH-СН2-СН2-COOH + ? →сукцинатдегидрогеназа→ СООН-CH=CH-СООН + ?

8. Какие элементы отсутствуют в уравнениях:

а) Н2СО + ? → ? + НСООН;

б) ? + 1/2О2 ксантиноксидаза> НСООН + ?

9.Напишите химическое уравнение реакции анаэробного дегидрирования первичного спирта с учетом всех необходимых компонентов.

10.Три названных ниже продукта могут составить окислительно-восста-

новительную цепь: 02, глутаминовая кислота, протеин-ФМН.

Построить цепь в последовательности: донатор - промежуточный акцептор протонов и электронов - конечный акцептор.

11.Как изменится теплопродукция органа, если блокирована НАД-деги- дрогеназа, но сохранена функция, других компонентов дыхательной цепи? В качестве субстрата используется глутаминовая кислота (до повреждения орган продуцировал 50 кал/мин).

12.Коэффициент Р/О исследуемой ткани снизился с 3 до 2 (с 3 до 1). Какой процесс, на каких этапах нарушен в первом и втором случаях?

13.В пробирке создана система, содержащая неповрежденные митохондрии, обеспечивается доступ кислорода, присутствуют достаточные количества АДФ и неорганического фосфата.

Подберите из перечисленных ниже субстратов такие, окисление кото-

рых может обеспечить коэффициент Р/О, равный.2 или 3: глюкоза, гли-

цериновый альдегид, глутаминовая кислота, НАД Н+, НАДФ Н+, янтарная кислота.

30

14. Как изменится концентрация неорганического фосфата и АДФ в системе, содержащей неповрежденные митохондрии и обильно снабжаемой способным к окислению субстратом: 1) в присутствии 2,4-динитрофенола, 2) в отсутствие 2,4-динитрофенола.

Аргументировать ответ

Занятие 9 (итоговое).

При подготовке к занятию в порядке самоконтроля определить с помощью следующих вопросов, усвоены ли Вами разделы «Ферменты» и «Биологическое окисление» (использовать материалы лекций, учебники).

1.Природа и свойства ферментов.

2.Номенклатура и классификация ферментов.

3.Принципы определения и выражения активности ферментов.

4.Кинетика ферментативных процессов; эффекторы ферментативных реакций (ингибиторы и активаторы);

8.Современные представления о биологическом окислении (тканевое дыхание и окислительное фосфорилирование).

9.Ферменты тканевого дыхания – локализация, последовательность размещения, понятия «донатор-акцептор» протонов и электронов, водород- и эелектронтранспортные участки, конечный акцептор электронов и протонов

10.Типы дегидрирования.

11.Механизмы сопряжения и разобщения (фактор сопряжения, разобщающие факторы, коэффициент Р/О).

31