- •Ход работы. К 5 каплям раствора белка добавить 5 капель 0,1%-ного раствора нингидрина, кипятить 1-2 мин - появляется розово-фиолетовое или сине-фиолетовое окрашивание.
- •ЗАНЯТИЕ 2 («Хроматографическое разделение аминокислот. Высаливание белков. Количественное определение белков»)
- •График зависимости оптической плотности растворов белка в пробах с сульфосалициловой кислотой от концентрации белка
- •1. Как узнать, осажден ли полностью белок из биологической жидкости после 50% насыщения её сульфатом аммония?
- •Дополнительные сведения: жидкость после 50% насыщения сульфатом аммония и фильтрования прозрачна.
- •Аудиторная работа
- •Лабораторная работа (Определение компонентов фосфо-
- •ЗАНЯТИЕ 4 (итоговое)
- •Занятие 5 (Влияние температуры и реакции среды на каталитическую активность ферментов. Специфичность ферментов)
- •Аудиторная работа.
- •1. Выявление ускоряющего и замедляющего влияния на ферменты.
2.Исследуемая биологическая жидкость при нагревании с нингидрином приобретает фиолетовое окрашивание. Содержатся ли в исследуемой жидкости соединения белковой природы?
3.Исследуемая жидкость при нагревании с реактивом Миллона приобретает кирпично-красный цвет.
Свидетельствует ли это о присутствии белка?
4.Реакция Фоля с биологической жидкостью положительна.
Ваши выводы, нужна ли дополнительная информация?
5. Можно ли установить присутствие свободных аминокислот в растворе белка, располагая реактивами только для нингидриновой пробы?
Используя учебник, проделайте следующее:
1. Запишите определение понятия «белковая молекула»,
2.Изобразите структурные формулы протеиногенных аминокислот,
3.Разделите их в зависимости от строения радикала на циклические и ациклические,
4.Разделите их в зависимости от характера дополнительной функциональной группы.
ЗАНЯТИЕ 2 («Хроматографическое разделение аминокислот. Высаливание белков. Количественное определение белков»)
Цель занятия: 1) ознакомиться с физико-химическими свойствами белков (молекулярная масса, растворимость, электролитические свойства, денатурация, амфотерность), с видами связи аминокислот в белковой молекуле, со строением полипептидной цепи, её пространственной структурой и химическими связями, поддерживающими пространственную конфигурацию, с классификацией белков, с важнейшими представителями простых белков; 2) выполнить лабораторную работу по осаждению белков высаливанием, определить количество белка в исследуемой жидкости; 3) познакомиться с простейшим приёмом хроматографического разделения аминокислот.
Студент должен знать следующее:
1.Почему для определения молекулярной массы /ММ/ белков неприемлемы эбулиоскопический и криоскопический методы.
2.Принципы осмометрического и диффузионного методов, принцип метода ультрацентрифугирования.
3.Принцип и технические приёмы гель-фильтрации.
4.Чем обусловлена растворимость белка в воде, какие факторы или
7
воздействия её изменяют, содержание термина «высаливание», в каких целях используется высаливание.
5.Понятия «нативный» и «денатурированный» белок, виды денатурирующих воздействий; изменения, происходящие при денатурации, а также разницу между коагуляцией (осаждением) и денатурацией.
6.От чего зависит заряд белковой молекулы, значение понятий «изоэлектрическая точка» и «изоэлектрическое состояние».
7.Принцип разделения аминокислот хроматографическими методами.
8.Принципы классификации соединений белковой природы в зависимости от состава (наличие или отсутствия компонентов, не являющихся аминокислотами).
9.Классификацию простых белков (протеинов), в частности, простых белков животного организма
Студент должен уметь:
1.Различать по данным о качественном составе белковой молекулы простые и сложные белки.
2.Различать на основании данных об аминокислотном составе и о молекулярной массе /ММ/ протеины и полипептиды.
3.Рассчитать ММ простого белка по его аминокислотному составу.
4.Ориентировочно (на уровне «растворим» или «плохо растворим») прогнозировать растворимость белка в воде по данным об его аминокислотном составе.
Студент должен получить представление:
1.О принципах определения молекулярной массы белков методом гельфильтрации и ультрацентрифугирования,
2.Об использовании в медицинской практике свойства белков осаждаться тяжелыми металлами,
3.О том, как используют данные об электрофоретической подвижности белков в диагностических целях,
4.О значении данных об аминокислотном составе пищевых белков как критерия полноценности рационов питания.
Сведения из базовых дисциплин, необходимые для изучения темы:
1)расчет ММ по структурной формуле соединения,
2)сведения о «гидратной» воде,
8
3)сведения об осмотическом давлении, его связи с ионным составом и концентрацией ионов,
4)сведения о реакциях гидролиза,
5)понятие о началах термодинамики,
6)сведения о принципе и технике колориметрии и нефелометрии.
Аудиторная работа
Лабораторная работа (Хроматографическое разделение аминокислот - демонстрация прибора и хроматограммы. Высаливание белков, их количественное определение)
1.Высаливание белков сыворотки крови сульфатом аммония может использоваться для разделения альбуминов и глобулинов, так как глобулины осаждаются при 50%-ном насыщении сульфатом аммония, а альбумины - при 100%-ном насыщении.
Ход работы. В пробирку внести 2 мл сыворотки крови и прибавить столько же насыщенного раствора сульфата аммония. Образующийся осадок отфильтровать - на фильтре при этом останутся глобулины. К фильтрату добавить сухого тонко измельченного порошка сульфата аммония до насыщения. Образующийся при этом осадок, представленный альбуминами, отделить фильтрованием.
Высаливание сульфатом аммония обратимо. В этом можно убедиться, поместив фильтры с осадком белка в воду - происходит растворение осадка.
2.Количественное определение белка в моче основано на реакции оса-
ждения белка сульфосалициловой кислотой и определении мутности осадка (нефелометрическое определение).
Ход работы:
А. Опытная проба - 1) в центрифужную пробирку внести 1.25 мл фильтрата мочи и добавить до 5 мл раствора сульфосалициловой кислоты; 2) экспонировать 5 мин; 3) внести пробу после экспозиции в кювету (10 мм) фотоэлектроколориметра и определить (против воды) плотность образовавшейся мути, используя оранжевый фильтр.
Б. Контрольная проба: внести в центрифужную пробирку вместо сульфосалициловой кислоты 1,25 мл дистиллированной воды и далее воспроизвести пункты 2- и 3 основного опыта.
Найти разницу между оптической плотностью опытной и контрольной проб и учесть результат по калибровочному графику.
Представленный график (см. следующую страницу) построен по результатам определения оптической плотности растворов альбумина с известной концентрацией при добавлении к ним сульфосалициловой кислоты: на оси абсцисс отложены значения концентраций белка (в %), на оси
9