2. Определение антинуклеарных антител методом иммунофлюоресценции
а. Определение. Антинуклеарные антитела — это антитела, связывающиеся с теми или иными структурами клеточного ядра. Чаще всего для определения антинуклеарных антител используется непрямая иммунофлюоресценция.
б. Методы выявления. В качестве клеточного субстрата используются замороженные срезы, например пищевода обезьяны, печени крысы, или препараты, приготовленные из суспензии клеток с крупными ядрами, например из человеческих клеток линии HEp-2. Определение антинуклеарных антител проводят следующим образом: 1) клеточный субстрат инкубируют с исследуемой сывороткой; 2) отмывают от несвязавшихся сывороточных белков; 3) инкубируют в присутствии меченных флюоресцеином антител к человеческим иммуноглобулинам, после чего вновь отмывают; 4) исследуют с помощью флюоресцентного микроскопа. Антинуклеарные антитела, содержащиеся в исследуемой сыворотке, связываются с клеточным субстратом, а затем — с мечеными антителами против иммуноглобулинов. Если сыворотка не содержит антинуклеарных антител, меченые антитела, добавленные к клеточному субстрату, при отмывке удаляются (см. рис. 15.2). Для определения титра антинуклеарных антител исследование проводят с серийными разведениями исследуемой сыворотки. Каждая лаборатория сама устанавливает нормальные показатели титра антинуклеарных антител, поскольку они зависят от типа клеточного субстрата и способа его фиксации. Чаще всего для выявления антинуклеарных антител используется культура человеческих клеток HEp-2 (клетки рака гортани), содержащих много ядерных антигенов: Ro/SS-A, ядерный антиген пролиферирующих клеток и антигены центромеры. Использование меченых антител к разным классам иммуноглобулинов показало, что большинство антинуклеарных антител относятся к IgG.
в. Диагностическая значимость. Основная цель исследования антинуклеарных антител — исключить СКВ, поскольку при этом заболевании антинуклеарные антитела появляются в сыворотке 95% больных в течение 3 мес после начала заболевания. Антинуклеарные антитела выявляются не только при СКВ, они могут обнаруживаться у пожилых, появляются при применении некоторых лекарственных средств, а также при некоторых артритах .Если титр антинуклеарных антител повышен, необходимо определить, к какому антигену они направлены ), так как при разных аутоиммунных заболеваниях выявляются антинуклеарные антитела разной специфичности .Титр антинуклеарных антител не позволяет судить об активности заболевания и эффективности лечения.
1) Тип окрашивания (характер распределения флюоресцентной метки в клетках) при разных заболеваниях неодинаков и определяет направление дальнейшего исследования антинуклеарных антител. Исследуемая сыворотка может содержать антинуклеарные антитела разной специфичности, однако тип окрашивания определяется теми антителами, которые присутствуют в наибольшем титре.
а) Диффузное окрашивание (равномерное распределение метки) наименее специфично и встречается чаще всего при СКВ, лекарственном волчаночном синдроме и других аутоиммунных заболеваниях, а также у пожилых). При диффузном окрашивании клеток реакцию повторяют с большим разведением исследуемой сыворотки. Если тип окрашивания остается прежним, наиболее вероятно, что антиген, против которого направлены антинуклеарные антитела, — дезоксирибонуклеопротеид.
б) Периферическое окрашивание наблюдается, когда в исследуемой сыворотке преобладают антитела к ДНК. Этот тип окрашивания часто встречается при волчаночном нефрите.
в) Пятнистое окрашивание обусловлено антителами к экстрагируемым ядерным антигенам и обычно наблюдается при системной склеродермии, смешанном заболевании соединительной ткани, синдроме Шегрена, лекарственном волчаночном синдроме.
г) Нуклеолярное окрашивание (распределение метки в районе ядрышек) обусловлено антителами к рибонуклеопротеиду .Этот тип окрашивания характерен для системной склеродермии, изредка встречается и при других аутоиммунных заболеваниях.
Д. Исследование специфичности антинуклеарных и других аутоантител