6.1.1. Простейшая схема взаимодействия клетки с субстратом

Представим себе простейшую кинетическую схему автокаталитической реакции с разложением каталитических центров

S + N2N + P, (6.4)

где N—число центров, претерпевающих удвоение при взаимо­действии с субстратом; Р- продукт.

Число центров, с которыми взаимодействует субстрат, и число клеток микроорганизмов связаны между собой прямо пропорциональной связью, поскольку предполагается, что клетки в среднем содержат одинаковое число центров, на которых осуществляется трансформация субстрата. В рамках кинетического приближения частоту актов деления клеток можно обозначить константой k. Субстрат S в результате взаимодействия с компонентами клетки трансформируется с образованием продукта Р.

Динамику изменения в системе концентрации компонентов будут описывать уравнения

(6.5)

(6.6)

где У_p - коэффициент пропорциональности, связывающий количество образовавшейся биомассы и продукта ферментационного превращения:

N – N₀=У_р(Р - Р₀). (6.7)

Если концентрация вещества S в системе достаточно велика и за время процесса меняется несущественно, то можно ее считать величиной постоянной (S=S₀). В этом случае уравнение (6.5) может быть проинтегрировано относительно числа клеток N. Если использовать начальное условие (τ=0, N=Nо), интегрирование уравнения (6.5) дает экспоненциальную функцию

(6.8)

Подстановка уравнения (6.8) в дифференциальное уравнение (6.6) и последующее его интегрирование (при допущении, что P₀=0) приводит к следующей зависимости от времени концент­рации продукта:

(6.9)

При временах реакции, близких к нулю (τ<<), концентрация продукта близка к нулю, при больших временах реакции должен наблюдаться экспоненциальный рост концентрации продукта:

(6.10)

Уравнения (6.8), (6.10) и соответственно кинетическая схема (6.4) описывают важную особенность кинетики роста микробной популяции—количество клеток в системе экспоненциально растет во времени. Удельная скорость роста μ, представляющая собой показатель экспоненты в уравнениях (6.8) и (6.10), является линейной функцией концентрации субстрата:

μ=kS₀ (6.11)

Уравнение (6.11) в отличие от уравнения Моно дает линейное неограниченное увеличение удельной скорости роста микроорганизмов с увеличением концентрации субстрата. Это противоречит экспериментальным данным и требует дополнительного усложнения простейшей кинетической схемы (6.4).

6.2. Пределы скорости роста культур микроорганизмов

Представляет интерес анализ числовых значений параметров µ_m и К_S входящих в уравнение скорости роста микроорганизмов. Значение µ_m характеризует время увеличения популяции микроорганизмов в е раз и может быть сопоставлено со временем удвоения каждой клетки:

(6.12)

В рамках всех рассмотренных моделей параметр К_S связан с константой Михаэлиса наиболее медленно работающего фермента, осуществляющего конверсию лимитирующего субстрата.

По литературным данным был составлен пул значений μ_m и К_S для различных популяций микроорганизмов. Всего было использовано около 50 значений для каждого из параметров, характеризующих рост культур на лимитирующем субстрате. Значения μ_m найденных величин варьировали в диапазоне 10^-2- 10^-5 c^-1, значения К_S в диапазоне 10^-2-10^-8M.

Значения параметров процесса удобно характеризовать функцией плотности распределения. Для получения представлений о распределении величины весь пул найденных значений был разбит на группы с приблизительно одинаковыми значениями К_S в пределах одного порядка. Далее было подсчитано число значений в каждой группе и полученная величина разделена на общее число значений в пуле. Тем самым найдена вероятность обнаружения величин с заданным значением константы К_S.

На рис. 6.4 приведены полученные значения плотности распределения как функции логарифма значений К_S. Кривая распределения близка к нормальному логарифмическому распределению. Эта функция дает представление о вероятностных значениях К_S для любого микроорганизма и субстрата, а также позволяет подсчитать вероятность нахождения величины в заданном интервале значений. Из рисунка видно, что с вероятностью около 0,5 наугад взятый организм будет характеризоваться константой сродства с лимитирующим субстратом, равной 10^-5 М.

Рис. 6.4. Плотность распределения кинетических характеристик ферментативных реакций (К_S,, К_М - в М) и кинетических параметров роста микробных популяций (μ_m, k_кат в с^-1)

Для сравнения на этом же рисунке приведены плотности распределения констант Михаэлиса для ферментативных реакций.

Видно, что плотности распределения констант Михаэлиса ферментативных процессов и констант сродства субстратов к микроорганизмам в значительной степени перекрываются.

Особый интерес представляет анализ численных значений максимальных удельных скоростей роста микроорганизмов. Из рис. 6.4 видно, что значения μ_m лежат вокруг среднего значения μ_m,ср=10^-4 с^-1. Таким образом, среднее значение времени удвоения микробных клеток составляет около 2 ч. Это наиболее вероятное значение для наугад взятой популяции микроорганизмов. В выборке практически отсутствуют микроорганизмы, характеризуемые μ_m выше 10^-2 и ниже 10^-4.

Нижний предел скорости роста культур микроорганизмов определяется, по-видимому, малой жизнеспособностью популяции клеток, имеющих относительно низкие скорости роста.

Возникает вопрос: каковы физические механизмы, ограничивающие верхний предел скорости роста микроорганизмов? Абсолютный предел в скоростях удвоения клеток определяется скоростями синтеза полимерных молекул. Например, синтез молекулы ДНК занимает отрезок времени, превышающий 15 мин. Проиллюстрируем это простым расчетом. Молекула ДНК с М_r~10⁷ содержит ~10⁵ связей, ферментативно образуемых в процессе ее синтеза. Как известно, наиболее характерные числа оборотов ферментов равны около 10² c^-1(рис. 6.4), т. е. одна связь образуется за 10^-2 с. Если для синтеза полимера необходимым является последовательный рост полимерной цепи, то этот процесс может завершиться лишь за 10³ с.

Таким образом, значения максимальных удельных скоростей роста микроорганизмов, соответствующие значениям 2,0-2,5 ч^-1 являются, по-видимому, абсолютными предельными значениями скорости роста клеток микроорганизмов.

В лекции были рассмотрены кинетические модели роста популяции микроорганизмов для выявления связи между удельной скоростью роста популяции и концентрацией лимитирующего субстрата.

Кинетическое моделирование, как всякий модельный подход, позволяет проанализировать различные возможные механизмы процесса при последовательном усложнении схемы процесса. Была рассмотрена простейшая схема с равновесным «насыщением» клетки субстратом. Вообще можно записать бесчисленное число кинетических схем, решения которых приводят к зависимости удельной скорости роста от концентрации субстрата типа уравнения Моно или Михаэлиса—Ментен. Необходимым общим элементом всех этих схем является по крайней мере двухстадийность процесса. Таким образом, уравнение Моно — отражение многостадийности трансформации субстрата, при этом первая стадия процесса является субстрат-зависимой, скорость второй стадии не зависит от концентрации субстрата.

При анализе кинетических схем весьма полезны упрощенные методы анализа, прежде всего метод малого параметра перед производной. Этот подход позволяет получать приближенные решения для кинетических схем любой степени сложности.

Важными представляются оценки «типичных» значений кинетических параметров микробиологического роста—значе­ний максимальной удельной скорости роста и константы сродства к субстратам. Значения К_S для микробного роста по своему распределению весьма близки к константам Михаэлиса ферментативных реакций. Типичное значение μ_m=10^-4 т. е. среднее значение времени удвоения микробных клеток составляет около 2 ч.